Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

De Selleck A été cité par 81 Publications

Comparaison de produits

Description

Le kit Mouse Direct PCR permet une préparation rapide et une amplification PCR spécifiquement conçues pour le génotypage de souris. Le Buffer L et la Protease Plus digèrent rapidement la souris Protocol of Selleck Mouse Direct PCR Kit

1. Comparaison entre différentes méthodes

Réactif	Prix ($)	Méthode de génotypage
Réactif	Prix ($)	NaOH-HCL	Proteinase K	Selleck Direct PCR Kit
Lysis Buffer	Sigma, 0.010	+	+	Buffer L
Proteinase K	Sigma P6556, 1U/reaction, 0.034		+	Protease Plus
Phenol Chloroform	Sigma P3803, 200μL/reaction, 0.116	+	+
Alcohols	Sigma I9030, 459836, 0.084	+	+
Taq	NEB M0273X, 1U/reaction, 0.122	+	+	2 x M-PCR OPTI^TM Mix
dNTP	Sigma GE28-4065-64, 0.25mM, 0.066	+	+
MgCL₂, DNA Loading	Sigma, 0.010	+	+
Price ($) /Reaction		0.41	0.44	0.39

2. Comparaison des résultats PCR (souris de type sauvage)

Comparison of PCR results from wild-type mouse

Les puits 1 à 10 représentent différents amorces PCR. Deux dentre elles servent de contrôles négatifs (puits 9 et 10) qui naffichent des bandes quen utilisant léchantillon de souris transgénique. Par conséquent, le kit Mouse Direct PCR assure une spécificité PCR plus élevée, ce qui en fait un produit fiable pour la recherche scientifique.

3. Avantages

Advantages of the Selleck Mouse Direct PCR Kit

Analyse du résultat :
Le kit Mouse Direct PCR sapplique à la préparation déchantillons de queue, doreille et dorteil de souris. Aucune différence significative na été observée entre les groupes, qui digèrent à 55°C pendant 15 min ou 30 min. Le kit est également efficace pour lamplification de grands fragments (par exemple 3 Kb).
Remarque : Les amorces pour lamplification de fragments de 500 pb et 3 Kb sont conçues sur la base du gène GAPDH de la souris, tandis que les amorces pour les fragments de 1 Kb et 2 Kb sont conçues sur la base du gène Ppip5k2 de la souris.

4. Composants

Complete Kit	B40013 (200 rxns)	B40015 (500 rxns)
Buffer L	20 mL	25 mL x 2
Protease Plus	0.4 mL	1 mL
2 x M-PCR OPTI^TM Mix (Dye Plus)	1 mL x 2	1 mL x 5
User Guide	1	1

Buffer L : Tampon de lyse.

Protease Plus : Pour une digestion rapide et efficace du tissu de souris en seulement 15 minutes !

2x M-PCR OPTI^TM Mix : Inclut la Taq ADN polymérase, les dNTP, le MgCl₂ et le tampon de réaction optimisés et brevetés de Selleck.

Stockage (à partir de la date de réception)

Le 2 x M-PCR OPTI^TM Mix et la Protease Plus doivent être conservés à -20°C pendant 2 ans. Si le PCR Mix doit être utilisé fréquemment, il peut être conservé à 4°C pendant 10 jours maximum.

Le Buffer L doit être conservé à 4°C.

Protocole

1. Protocole expérimental

1) Préparation de lADN génomique
Placez la queue, loreille ou lorteil de la souris dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Mélangez soigneusement 100 μL de Buffer L frais avec 2 μL de Protease Plus pour un seul échantillon dans un tube séparé. Ajoutez le mélange de protéase aux tubes de tissu de souris avec le tissu coupé immergé, puis incubez à 55°C pendant 15 minutes. Après le processus de digestion, incubez à 95°C pendant 5 minutes pour inactiver la protéase. Le lysat tissulaire peut maintenant être utilisé comme matrice PCR.

2) Génotypage PCR
Ajoutez de leau dd H₂O, des amorces, la matrice et le 2 x M-PCR OPTI^TM Mix dans un tube PCR selon les concentrations recommandées. Mélangez rapidement au centrifugeuse et chargez dans lamplificateur PCR pour commencer lamplification. Il est recommandé de préparer la réaction PCR dans un bain de glace.

Composants de la réaction PCR	20 μL Volume de réaction (μL)	50 μL Volume de réaction (μL)
ddH₂O	8	21
Amorce avant (10 μM)	0.5	1
Amorce arrière (10 μM)	0.5	1
Matrice	1	2
2 x M-PCR OPTI™ Mix	10	25

Étapes PCR	Température (°C)	Heure	Cycles
1	94	5 min	1
2	94	20 sec	35
3	50-65	30 sec
4	72	X min (2 kb /min)
5	72	5 min	1
6	12	--	1

Remarque : Avant la première utilisation
1. Tous les réactifs de ce kit ont été optimisés pour être utilisés ensemble et toute modification ou utilisation alternative est interdite.
2. Pour chaque étape, assurez-vous que chaque réactif du kit est bien mélangé avant utilisation.
3. Pendant létape de digestion tissulaire, agiter les tubes 1 à 2 fois sera utile pour libérer lADN génomique.
4. Pour la plupart des échantillons de tissus de souris, une incubation de 15 minutes à 55°C suffira pour lextraction de lADN génomique. Le tissu peut toujours sembler intact, mais lextraction a eu lieu.
5. LADN génomique de souris extrait doit être appliqué immédiatement avant létape damplification PCR. Un stockage inapproprié à long terme peut entraîner des amplifications PCR peu fiables.

Dépannage

Veuillez consulter les options de dépannage suivantes si vous rencontrez des difficultés techniques. Vous pouvez également contacter directement le support technique de Selleck.

Problème	Cause(s) potentielle(s)	Suggestion(s)
Pas de produit damplification dans les échantillons de test ou de contrôle	La réaction damplification a été mal configurée	Optimisez la configuration correcte de la réaction
	Un stockage inapproprié a entraîné une perte dactivité des réactifs PCR	Remplacez tous les composants par des réactifs frais
	Les amorces ne sont pas optimales et ne se sont pas hybridées	Redessiner les amorces
Lamplification a fonctionné dans les échantillons de contrôle, mais pas dans les échantillons de test	La digestion était incomplète	Prolongez le temps de digestion jusquà 30 minutes à 55°C
	Les échantillons ont été stockés trop longtemps et lADN génomique sest dégradé	Recueillir des échantillons frais de queue de souris pour lextraction dADN génomique
	La solution de lyse a été mélangée trop longtemps avec le mélange PCR	Les réactions PCR doivent être initiées dans les 5 heures suivant lajout de la matrice, et stockées à 4°C pendant ce temps
	La quantité de produit damplification nétait pas suffisante	Augmenter le nombre de cycles PCR à 35-40 pour obtenir plus de produit damplification
Produit(s) damplification non spécifique(s)	La température dhybridation était trop basse	Augmenter la température dhybridation
	Le nombre de cycles PCR était trop élevé	Diminuer le nombre de cycles à 30-35
	La concentration damorce était trop élevée	Diminuer la concentration damorce
	La concentration de matrice était trop élevée	Diluer la matrice dans de leau purifiée H₂O ou du tampon TE

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Manual
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