KU-0063794

Comparé à l'inhibiteur de mTOR PP242, KU-0063794 présente une spécificité plus élevée pour mTOR, étant inactif contre les PI3Ks ou 76 autres kinases. Dans les cellules HEK-293, ce composé à 30 nM est suffisant pour ablater rapidement l'activité de S6K1 en bloquant la phosphorylation du motif hydrophobe (Thr³⁸⁹) et, par conséquent, la phosphorylation du résidu de la boucle T (Thr²²⁹). Dans le cas de la stimulation par IGF1 des cellules HEK-293 privées de sérum, 300 nM de ce composé sont nécessaires pour inhiber l'activité de S6K1 d'environ 90 %. Ce produit chimique à 100-300 nM inhibe également complètement la phosphorylation induite par les acides aminés de S6K1 et de la protéine S6. Similaire à S6K1, il inhibe la phosphorylation de mTORC1 à Ser²⁴⁴⁸ et de mTORC2 à Ser²⁴⁸¹ de manière dose-dépendante et temps-dépendante. En présence de sérum ou suite à une stimulation par IGF1, ce composé induit une inhibition dose-dépendante de l'activité et de la phosphorylation d'Akt à Ser⁴⁷³ et de Thr³⁰⁸ inattendue, ainsi que la phosphorylation des substrats d'Akt PRAS40 à Thr²⁴⁶, GSK3α/GSK3β à Ser²¹/Ser⁹ et Foxo-1/3a à Thr²⁴/Thr³². Ce composé, mais pas la rapamycine, inhibe l'activité de SGK1 et la phosphorylation de Ser⁴²² ainsi que de son substrat physiologique NDGR1 de manière dose-dépendante, dans la même mesure que la phosphorylation de S6K1 et d'Akt, tandis qu'il n'inhibe pas la phosphorylation d'ERK ou de RSK induite par l'ester de phorbol et l'activation de RSK. Comparé à la rapamycine, ce produit chimique présente une puissance plus significative pour induire la déphosphorylation complète de 4E-BP1 à Thr³⁷, Thr⁴⁶ et Ser⁶⁵. Il inhibe la croissance cellulaire des MEF de type sauvage et déficients en mLST8 et induit un arrêt du cycle cellulaire en G1, de manière plus significative que la rapamycine. [1]

Ku0063794 inhibe la croissance tumorale et la signalisation mTOR dans un modèle préclinique de carcinome rénal. Cependant, ce composé n'a pas été plus efficace dans l'étude animale. Une explication possible du manque d'activité plus importante in vivo pour ce produit chimique[2].

• Tests kinases des complexes mTOR

  Les cellules HEK-293 sont fraîchement lysées dans un tampon de lyse Hepes. Le lysat (1-4 mg) est pré-clairifié par incubation avec 5-20 μL de Protéine G-Sepharose conjuguée à une IgG pré-immune. Les extraits de lysat sont ensuite incubés avec 5-20 μL de Protéine G-Sepharose conjuguée à 5-20 μg d'anticorps anti-Rictor ou anti-Raptor, ou d'IgG pré-immune. Tous les anticorps sont conjugués de manière covalente à la Protéine G-Sepharose. Les immunoprécipitations sont effectuées pendant 1 heure à 4 °C sur une plateforme vibrante. Les immunoprécipités sont lavés quatre fois avec un tampon de lyse Hepes, suivis de deux lavages avec un tampon kinase Hepes. Pour les immunoprécipités de Raptor utilisés pour phosphoryler S6K1, pour les deux premières étapes de lavage, le tampon inclut 0,5 M NaCl pour assurer une activité kinase optimale. GST-Akt1 est isolé de cellules HEK-293 privées de sérum incubées avec PI-103 (1 μM pendant 1 heure). GST-S6K1 est purifié à partir de cellules HEK-293 privées de sérum incubées avec de la rapamycine (0,1 μM pendant 1 heure). Les réactions mTOR sont initiées par l'ajout de 0,1 mM d'ATP et 10 mM de MgCl₂ en présence de différentes concentrations de KU-0063794 et de GST-Akt1 (0,5 μg) ou de GST-S6K1 (0,5 μg). Les réactions sont effectuées pendant 30 minutes à 30 °C sur une plateforme vibrante et arrêtées par l'ajout de tampon d'échantillon SDS. Les mélanges réactionnels sont ensuite filtrés à travers un filtre Spin-X de 0,22 μm et les échantillons sont soumis à électrophorèse et analyse par immunotransfert avec les anticorps indiqués.

• Lignées cellulaires

  Wild-type and mLST8 deficient MEFs

• Concentrations

  Dissolved in DMSO, final concentration ~3 μM

• Temps dincubation

  24, 48, and 72 hours

• Méthode

  Cells are treated with KU-0063794 for 24, 48, and 72 hours, and the medium is changed every 24 hours with freshly dissolved this compound. For the measurement of cell growth, cells are washed once with PBS, and fixed in 4% (v/v) paraformaldehyde in PBS for 15 minutes. After washing once with water, the cells are stained with 0.1% Crystal Violet in 10% ethanol for 20 minutes and washed three times with water. Crystal Violet is extracted from cells with 0.5 mL of 10% (v/v) ethanoic (acetic) acid for 20 minutes. The eluate is then diluted 1:10 in water and absorbance at 590 nm is quantified. For the assessment of cell cycle distribution, cells are harvested by trypsinization, washed once in PBS, and re-suspended in ice-cold aq. 70% (v/v) ethanol. Cells are washed twice in PBS plus 1% (w/v) BSA and stained for 20 minutes in PBS plus 0.1% (v/v) Triton X-100 containing 50 g/mL propidium iodide and 50 g/mL RNase A. The DNA content of cells is determined using a FACSCalibur flow cytometer and CellQuest software. Red fluorescence (585 nm) is acquired on a linear scale, and pulse width analysis is used to exclude doublets. Cell-cycle distribution is determined using FlowJo software.

• Modèles animaux

  Nu/Nu nude mice

• Dosages

  8 mg/kg

• Administration

  i.p.