Selisistat (EX-527)

Selisistat (EX 527) exerce un effet inhibiteur puissant contre l'activité déacétylase de SIRT1 de manière concentration-dépendante avec une IC50 de 38 nM, et présente une activité beaucoup plus faible contre SIRT2 et SIRT3 avec des valeurs d'IC50 de 19,6 µM et 48,7 µM, respectivement. Il n'inhibe pas l'activité des SIRT4-7 et des HDAC de classe I/II à des concentrations allant jusqu'à 100 µM. Ce composé seul (1 µM) n'a pas d'effet détectable sur l'acétylation de la lysine 382 de p53 dans les cellules NCI-H460, mais augmente significativement la quantité de p53 acétylée dans les cellules NCI-H460, les cellules épithéliales mammaires humaines, les cellules U-2 OS et MCF-7 soumises à des agents génotoxiques comme le peroxyde d'hydrogène, ce qui est plus efficace que celui causé par le Nicotinamide (5 mM). Étonnamment, il n'entraîne pas d'effets détectables sur l'expression génique contrôlée par p53, la survie cellulaire ou la prolifération cellulaire. [1] Il provoque une augmentation de 90% du nombre de cellules HCT116 après 7 jours dans la condition de 0,1% de sérum mais pas de 10% de sérum, suggérant que SIRT1 est un régulateur significatif de la prolifération cellulaire pendant les conditions de privation de facteur de croissance. [2] De plus, il annule les effets du resvératrol sur les réponses au glucose et prévient la régulation positive induite par le resvératrol de Glut2, glucokinase, Pdx-1 et Tfam dans les cellules INS-1E, en raison de l'effet opposé d'EX 527 et du resvératrol sur l'activité déacétylase de SIRT1. [3]

L'administration de Selisistat (EX 527 ; ~10 µg) à des rats augmente les niveaux d'acétyl-p53 hypothalamiques en inhibant l'activité de SIRT1 hypothalamique. La co-administration de ce composé avec la ghréline atténue fortement l'action orexigène de la ghréline en diminuant les niveaux de pAMPK, en augmentant les niveaux d'ACC et en abolissant l'expression plus élevée des facteurs de transcription FoxO1, pCREB et Bsx et des neuropeptides NPY et AgRP dans le noyau arqué hypothalamique. [4]

• Inhibition de l'activité déacétylase de GST-SIRT1

  Les cellules 293T sont transfectées transitoirement avec SIRT1 humain marqué GST dans le vecteur pDEST27 Gateway à l'aide de FuGENE-6. Après 48 heures, les cellules sont lysées avec 50 mM Tris, pH 8,0, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA et 0,5% de Nonidet P-40, complétés par des comprimés de cocktail d'inhibiteurs de protéase Complete Mini. La GST-SIRT1 est purifiée à partir des lysats et lavée abondamment dans le tampon ci-dessus. Le test de déacétylation est réalisé avec environ 30 ng de GST-SIRT1 en présence de Selisistat (EX 527) (48 pM à 100 μM). La déacétylation est mesurée à l'aide du kit Fluor de Lys en utilisant un peptide fluorogénique comprenant les résidus 379 à 382 de p53, acétylé sur la lysine 382. Le résidu de lysine acétylé est couplé à une fraction aminométhylcoumarine. Le peptide est déacétylé par SIRT1, suivi de l'ajout d'un développeur protéolytique qui libère l'aminométhylcoumarine fluorescente. En bref, les préparations enzymatiques sont incubées avec 170 μM de NAD⁺ et 100 μM de peptide fluorogénique p53 pendant 45 minutes à 37 °C, suivies d'une incubation dans le développeur pendant 15 minutes à 37 °C. La fluorescence est mesurée par excitation à 360 nm et émission à 460 nm et l'activité enzymatique est exprimée en unités de fluorescence relative.

• Lignées cellulaires

  NCI-H460, MCF-7, U-2 OS and HMEC

• Concentrations

  Dissolved in DMSO, final concentration 1 μM

• Temps dincubation

  48 or 72 hours

• Méthode

  For viability assays, cells are treated with Selisistat (EX 527) for 48 hours. Cell viability is then determined using the Cell Titer-Glo luminescent assay, which measures total ATP level as an index of cell number. Luminescence is measured on a Luminoskan Ascent. For the proliferation assay, 0.5 μCi/mL of [¹⁴C]thymidine is added to the medium immediately after this compound. Plates are counted at 48 hours (HMEC) or 72 hours (NCI-H460, MCF-7, and U-2 OS cells) in a Microbeta liquid scintillation counter. Thymidine incorporated by the cells is detected by proximity to the scintillant in the base of the Cytostar-T tissue culture plate.

• Modèles animaux

  Male Sprague-Dawley rats

• Dosages

  ~5 μg/rat

• Administration

  Intracerebroventricular injection