Selisistat (EX-527)

Selisistat (EX 527) vertoont een krachtig remmend effect tegen SIRT1 deacetylase-activiteit op een concentratieafhankelijke manier met een IC50 van 38 nM, en vertoont veel lagere activiteit tegen SIRT2 en SIRT3 met IC50-waarden van respectievelijk 19,6 µM en 48,7 µM. Het remt SIRT4-7 en klasse I/II HDAC-activiteit niet bij concentraties tot 100 µM. Deze verbinding alleen (1 µM) heeft geen detecteerbaar effect op de acetylering van p53 lysine 382 in NCI-H460-cellen, maar verhoogt significant de hoeveelheid geacetyleerd p53 in NCI-H460-cellen, menselijke borstklier epitheelcellen, U-2 OS- en MCF-7-cellen die zijn blootgesteld aan genotoxische stoffen zoals waterstofperoxide, wat effectiever is dan dat veroorzaakt door Nicotinamide (5 mM). Verrassend genoeg heeft het geen detecteerbare effecten op p53-gecontroleerde genexpressie, celoverleving of celproliferatie. [1] Het veroorzaakt een toename van 90% in het aantal HCT116-cellen na 7 dagen in de conditie van 0,1% serum, maar niet 10% serum, wat suggereert dat SIRT1 een significante regulator is van celproliferatie tijdens groeifactor-deprivatie omstandigheden. [2] Bovendien heffen de effecten van resveratrol op glucoseresponsen op, en voorkomt resveratrol-geïnduceerde opregulatie van Glut2, glucokinase, Pdx-1 en Tfam in INS-1E-cellen, vanwege het tegenovergestelde effect van EX 527 en resveratrol op SIRT1 deacetylase-activiteit. [3]

Toediening van Selisistat (EX 527; ~10 µg) aan ratten verhoogt de hypothalamus acetyl-p53-niveaus door de hypothalamus SIRT1-activiteit te remmen. Gelijktijdige toediening van deze verbinding met ghreline vermindert de orexigene werking van ghreline aanzienlijk door de pAMPK-niveaus te verlagen, de ACC-niveaus te verhogen en de hogere expressie van de transcriptiefactoren FoxO1, pCREB en Bsx en de neuropeptiden NPY en AgRP in de hypothalamus arcuate nucleus op te heffen. [4]

• Remming van GST-SIRT1 deacetylase activiteit

  293T-cellen worden transient getransfecteerd met GST-getagd menselijk SIRT1 in de pDEST27 Gateway-vector met behulp van FuGENE-6. Na 48 uur worden de cellen gelyseerd met 50 mM Tris, pH 8,0, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA en 0,5% Nonidet P-40, aangevuld met Complete Mini protease-remmer cocktailtabletten. GST-SIRT1 wordt gezuiverd uit lysaten en uitgebreid gewassen in de bovengenoemde buffer. De deacetylase-assay wordt uitgevoerd met ongeveer 30 ng GST-SIRT1 in aanwezigheid van Selisistat (EX 527) (48 pM tot 100 μM). Deacetylatie wordt gemeten met behulp van de Fluor de Lys-kit met een fluorogeen peptide dat residuen 379 tot 382 van p53 omvat, geacetyleerd op lysine 382. Het geacetyleerde lysineresidu is gekoppeld aan een aminomethylcoumarine-eenheid. Het peptide wordt door SIRT1 gedeacetyleerd, gevolgd door de toevoeging van een proteolytische ontwikkelaar die het fluorescerende aminomethylcoumarine vrijgeeft. Kortom, enzympreparaten worden 45 minuten bij 37 °C geïncubeerd met 170 μM NAD⁺ en 100 μM p53 fluorogeen peptide, gevolgd door 15 minuten incubatie in ontwikkelaar bij 37 °C. Fluorescentie wordt gemeten door excitatie bij 360 nm en emissie bij 460 nm en enzymatische activiteit wordt uitgedrukt in relatieve fluorescentie-eenheden.

• Cellijnen

  NCI-H460, MCF-7, U-2 OS and HMEC

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentration 1 μM

• Incubatietijd

  48 or 72 hours

• Methode

  For viability assays, cells are treated with Selisistat (EX 527) for 48 hours. Cell viability is then determined using the Cell Titer-Glo luminescent assay, which measures total ATP level as an index of cell number. Luminescence is measured on a Luminoskan Ascent. For the proliferation assay, 0.5 μCi/mL of [¹⁴C]thymidine is added to the medium immediately after this compound. Plates are counted at 48 hours (HMEC) or 72 hours (NCI-H460, MCF-7, and U-2 OS cells) in a Microbeta liquid scintillation counter. Thymidine incorporated by the cells is detected by proximity to the scintillant in the base of the Cytostar-T tissue culture plate.

• Dierlijke modellen

  Male Sprague-Dawley rats

• Doseringen

  ~5 μg/rat

• Toediening

  Intracerebroventricular injection