NVP-BSK805 2HCl JAK Inhibitor

NVP-BSK805 is found to potently inhibit JAK2, whereas displaying more than 20-fold selectivity towards JAK1, JAK3, and TYK2. NVP-BSK805 causes half-maximal inhibition of full-length JAK2^V617F and JAK2 wild-type enzymes at 0.5 nM. NVP-BSK805 blocks the growth of JAK2^V617F cells (Ba/F3) and induces apoptosis with a GI50 at concentrations ＜100 nM. As constitutive STAT5 phosphorylation in dependent on JAK2, NVP-BSK805 is found to potently suppress STAT5 phophorylation at ≥ 100 nM concentrations in the JAK2 ^V617F -mutant cell lines, like MB-02. Incubation of SET-2 cells with 150 nM and 1µM of NVP-BSK805, which corresponds to concentration yielding 75% and 95% growth inhibition, respectively, for 24, 48, and 72 hours lead to concentration- and time- dependent induction of apoptosis. These results are evidenced by the detection of cleaved PARP, reduced Bcl-xL expression, and a strong increase in the number of cells with less than 2N DNA content. [1] NVP-BSK805 triggered cell death requires activation of caspase cascades and is overcome by caspase inhibition in both SET-2 and MB-02 cells. NVP-BSK805 modulates the post-translational modification of Bim and levels of Mcl-1 in JAK2^V617F cells, SET-2 and MB-02 cells. [2]

Enzymatische Assays

Die menschliche JAK2-Kinasedomäne (Aminosäuren 840-1132) ist in dem Plasmidkonstrukt pAcG2TtevJAK2 enthalten. Die Plasmidkonstrukte für JAK3 (813-1124), TYK2 (888-1187) und JAK1 (866-1154) sind entworfen. Die Erzeugung der rekombinanten Baculoviren mit BD BaculoGold^TM Bright linearisierter DNA, Plaque-Assay und Virusamplifikation aus einzelnen Plaques wird gemäß dem Handbuch (BD Biosciences Pharmingen) durchgeführt. Janus-Kinasedomänen werden in Sf9-Zellen in 400-mL-Schüttelkolben mit 100 mL ExCell420-Kulturmedium (JRH Biosciences Ltd) mit Penicillin/Streptomycin-Lösung für 48 Stunden bei 27 °C exprimiert. Suspensionskulturzellen werden bei einer Dichte von 1 × 10⁶ infiziert, und die Multiplizität der Infektion (MOI) für jedes Virus wird für die Ausbeute an löslichem Protein optimiert. Die Kinasedomäne der menschlichen JAK2 und von JAK1, JAK3 und TYK2 wird mit einem MOI von 1 bzw. 0,5 exprimiert. Die Expressionszeit bei 27 °C beträgt 48 Stunden für JAK2 und 48 Stunden oder 72 Stunden für JAK1, JAK3 und TYK2. Achtundvierzig oder zweiundsiebzig Stunden nach der Infektion werden die Zellen aus einer 100-mL-Expressionskultur durch Zentrifugation bei 3000 x g für 5 Minuten geerntet und mit 12 mL Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM Natriumorthovanadat, 1 % Triton X-100, 10 % Glycerin, 1 x EDTA-freiem kompletten Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche Diagnostics) und 12,5 U/mL Benzonase für 30 Minuten bei 4 °C lysiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 14.000 × g für 45 Minuten, um unlösliches Material zu pelletieren. Für die GST-Tag-Affinitätsreinigung von Kinasedomänenproteinen werden alle Schritte bei 4 °C durchgeführt. Die geklärten Lysate werden mit 0,2 mL einer 50 %igen Suspension von gewaschenem Glutathion-Sepharose 4B für 2 Stunden bei 4 °C inkubiert, gefolgt von 5 Waschschritten mit 1 mL 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT und 10 % Glycerin. Gebundenes Protein wird in 5 Aliquots eluiert, wobei jedes Aliquot mit einer 10-minütigen Inkubation mit 0,25 mL Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT, 10 % Glycerin, 10 mM reduziertes L-Glutathion) beginnt. Eluate werden mit Amicon Ultra-4 Spin-Säulen etwa 5-fach konzentriert. Nach Zugabe von Brij35 auf eine Endkonzentration von 0,1 % wird das Protein in kleinen Aliquots schockgefroren und bei -80 °C gelagert. Unter diesen Bedingungen sind die Kinaseaktivitäten für mindestens 6 Monate stabil. Die JAK-Kinasedomänenenzyme werden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem Medium inkubiert, das 0,1 μM [γ³³P]-ATP, 1 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂, 30 μM des synthetischen Peptidsubstrats EQEDEPEGDYFEWLE, 1 mM DTT, 1 % DMSO, 50 μg/mL BSA, 0,01 % Brij35 und 50 mM Tris-HCl pH 7,5 enthält. Die ATP-Konzentration liegt unter dem Km für alle Proteine. Die Kurven werden durch nichtlineare Regression unter Verwendung der logistischen Gleichung und der globalen Anpassungsfunktion von XLfit® (Modell 205) angepasst. Expression und Charakterisierung von Wildtyp und V617F-Mutante JAK2 in voller Länge sowie Kinase-Assay-Bedingungen wurden an anderer Stelle beschrieben. Die Kinase-Selektivität von NVP-BSK805 wird in einem internen Kinase-Panel bewertet: In den Caliper-Assays werden Kinase-Reaktionen mit Peptidsubstraten durchgeführt, die in einem elektrischen Feld bei Phosphorylierung mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten wandern. Die Peptide tragen eine Fluoreszenzmarkierung, um die Detektion und Quantifizierung der Peptide in einem Kapillarsystem zu ermöglichen. Die Peptidfluoreszenzintensitäten werden mit dem LC3000-Instrument (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA) quantifiziert. Die Kinaseaktivität wird durch Quantifizierung der in Lösung verbleibenden ATP-Menge nach einer Kinase-Reaktion gemessen. In den LanthaScreen™ TR-FRET-Kinase-Assays wird Terbium als Lanthanoichelat in Kombination mit einem Antikörper gegen das phosphorylierte Substrat verwendet.

Oral bioavailability of NVP-BSK805 in mice is estimated to be 45%, while it is 50% in rats. Oral administration of NVP-BSK805 at 150 mg/kg suppresses STAT5 phosphorylation, splenomegaly, and leukemic cell spreading in a Ba/F3 JAK2^V617F cell–driven mouse model. NVP-BSK805 suppresses rhEpo-induced STAT5 phosphorylation as well as rhEpo-mediated polycythemia and splenomegaly in BALB/c mice at doses of 25, 50, and 100 mg/kg orally. [1]