3-Methyladenine (3-MA)

Die leichte Präferenz für die Vps34-Prävention durch 3-Methyladenine (3-MA) resultiert wahrscheinlich aus einem hydrophoben Ring, der spezifisch für Vps34 ist und die 3-Methylgruppe dieser Verbindung umschließt. [1] Es wurde berichtet, dass es unter normalen und Hungerbedingungen den Tod von Krebszellen verursacht und auch die Zellmigration und Invasion unabhängig von seiner Fähigkeit, Autophagy zu hemmen, unterdrücken könnte, was impliziert, dass es andere Funktionen als die Autophagy-Unterdrückung besitzt. Diese Verbindung löst einen Caspase-abhängigen Zelltod aus, der unabhängig von der Autophagy-Hemmung ist. Die Behandlung mit 5 mM davon reduziert den Prozentsatz der Glukose-gehungerten HeLa-Zellen, die GFP-LC3-Punktate zeigen, auf 23%. Die LC3-I-Spiegel nehmen zu und die LC3-II-Spiegel nehmen zwischen 12 und 48 Stunden in Zellen ab, die mit 3-MA behandelt werden. Die Umwandlung von LC3-I zu LC3-II wird durch die Verbindung unterdrückt. Die Behandlung von HeLa-Zellen damit bei 2,5 mM oder 5 mM für einen Tag beeinflusst die Zellviabilität nicht, während die Behandlung mit 10 mM für einen Tag eine Abnahme der Zellviabilität um 25,0% verursacht. Die Behandlung von Zellen mit 2,5, 5 oder 10 mM für zwei Tage verursacht eine Abnahme der Viabilität um 11,5%, 38,0% bzw. 79,4%. Es verringert die Zellviabilität in einer zeit- und dosisabhängigen Weise und verkürzt die Dauer des Nocodazol-induzierten Prometaphase-Arrests erheblich. [2] Die Unterdrückung der Autophagy durch 3-MA hemmt den SU11274-induzierten Zelltod. [3] Eine verlängerte Behandlung damit (bis zu 9 Stunden) induziert eine signifikante LC3 I zu II Umwandlung in Wildtyp-MEFs. Eine verlängerte Behandlung mit 3-MA, aber nicht mit Wortmannin, erhöht die GFP-LC3-Punktation/-Aggregation deutlich. Die induzierte LC3-Umwandlung und die freie GFP-Freisetzung sind ATG7-abhängig. Die Behandlung damit führt zu einem evidenten Anstieg des p62-Proteinspiegels. Die Verbindung erhöht den p62-Spiegel sogar in Atg5−/− MEFs sowie in Zellen mit DOX-vermittelter Deletion von ATG5. Es hemmt Klasse I und Klasse III PI3K in verschiedenen zeitlichen Mustern. Die induzierte LC3 I zu LC3 II Umwandlung ist in Tsc2−/− Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Zellen dramatisch beeinträchtigt. Diese Verbindung stört die anti-autophagische Funktion des mTOR-Komplexes 1. [4]

3-Methyladenine (3-MA) blockiert Autophagy durch seine Wirkung auf die Klasse III Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K). Die Behandlung mit dieser Verbindung verändert das Ausmaß der Hämorrhagie im Vergleich zur Subarachnoidalblutung (SAH)-Gruppe nicht. Die Vorbehandlung verschlimmert die neurologischen Symptome im Vergleich zur SAH + Vehikel-Gruppe signifikant. Autophagy nimmt ab, wenn sie angewendet wird. Umgekehrt wird gespaltenes Caspase-3 in der SAH + 3-MA-Gruppe deutlich hochreguliert. Im Einklang mit der Hochregulation der gespaltenen Caspase-3-Expression ist die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen im rechten Kortex in der SAH + 3-MA-Gruppe im Vergleich zur SAH + Vehikel-Gruppe signifikant erhöht. [5]

• Proteinabbau-Assay

  HeLa-Zellen werden 24 Stunden lang mit 0,05 mCi/mL l-[U- ¹⁴C]Valin radioaktiv markiert. Am Ende der Markierungsperiode werden die Zellen dreimal mit PBS gespült. Die Zellen werden für die angegebenen Zeiten entweder in vollem Medium oder in EBSS mit oder ohne 10 mM 3-Methyladenine (3-MA) inkubiert.

• Zelllinien

  HeLa cell line

• Konzentrationen

  1-10 mM

• Inkubationszeit

  24, 48 or 72 hours

• Methode

  After treatment with 3-Methyladenine (3-MA), cell (such as HeLa cell) viability is determined by a trypan blue exclusion assay. Briefly, both adherent and floating cells are collected and suspended in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) at a final density of 1-2 × 10⁶/mL. An equal volume of 0.4% trypan blue solution (w/v, in PBS) is added to the cell suspension and mixed thoroughly. After incubation at room temperature for 3 min, cell counting is performed using a hemacytometer.

• Tiermodelle

  Adult male Sprague–Dawley rats weighing 300-350 g

• Dosierungen

  400 nM

• Verabreichung

  Intracerebral ventricular