A-966492

A-966492 ist einer der potentesten PARP-Inhibitoren. Diese Verbindung zeigt eine ausgezeichnete Potenz gegen das PARP-1-Enzym mit einem K_i von 1 nM und einem EC50 von 1 nM in einem Ganzzell-Assay. Es verbessert signifikant die Wirksamkeit von TMZ dosisabhängig. Darüber hinaus ist diese Chemikalie oral bei mehreren Spezies bioverfügbar, überwindet die Blut-Hirn-Schranke und scheint sich im Tumorgewebe zu verteilen. Es stellt ein vielversprechendes, strukturell vielfältiges Benzimidazol-Analogon dar und wird präklinisch weiter charakterisiert. [1]

A-966492 zeigt auch eine gute In-vivo-Wirksamkeit in einem subkutanen murinen Melanommodell B16F10 in Kombination und in einem MX-1-Brustkrebs-Xenograft-Modell sowohl als Einzelwirkstoff als auch in Kombination. Darüber hinaus besitzt diese Verbindung ausgezeichnete pharmazeutische Eigenschaften und hat in präklinischen Maus-Tumormodellen in Kombination mit TMZ sowie als Einzelwirkstoffaktivität in einem BRCA1-defizienten MX-1-Tumormodell eine In-vivo-Wirksamkeit gezeigt. Es wird weiter an Sprague-Dawley-Ratten, Beagle-Hunden und Cynomolgus-Affen charakterisiert, wobei diese Chemikalie orale Bioverfügbarkeiten von 34–72 % und Halbwertszeiten von 1,7–1,9 Stunden aufweist. In vivo zeigt es eine signifikante Verbesserung der Wirksamkeit von TMZ in einem murinen B16F10 syngenen Melanommodell, wobei die Kombinationsgruppen eine überlegene Wirksamkeit zeigen. [1]

• PARP Enzym-Assay

  Der Enzym-Assay wird in einem Puffer durchgeführt, der 50 mM Tris, pH 8,0, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 4 mM MgCl₂ enthält. PARP-Reaktionen enthalten 1,5 μM [³H]-NAD⁺ (1,6 μCi/mmol), 200 nM biotinyliertes Histon H1, 200 nM slDNA und 1 nM PARP-1 oder 4 nM PARP-2 Enzym. Autoreaktionen, die eine SPA-Bead-basierte Detektion verwenden, werden in 100 μL Volumen in weißen 96-Well-Platten durchgeführt. Die Reaktionen werden durch Zugabe von 50 μL 2X NAD⁺-Substratmischung zu 50 μL 2× Enzymmischung, die PARP und DNA enthält, initiiert. Diese Reaktionen werden durch Zugabe von 150 μL 1,5 mM Benzamid (ca. 1 × 10³-fach über seinem IC50) beendet. Eine Menge von 170 μL der gestoppten Reaktionsmischungen wird auf Streptavidin-beschichtete Flash Plates übertragen, 1 Stunde inkubiert und mit einem TopCount Microplate-Szintillationszähler gezählt. K_i-Daten werden aus Hemmkurven bei verschiedenen Substratkonzentrationen bestimmt.

• Zelllinien

  C41 cell

• Konzentrationen

  ~10 nM

• Inkubationszeit

  30 minutes

• Methode

  C41 cells are treated with A-966492 for 30 minutes in a 96-well plate. PARP are activated by damaging DNA with 1 mM H₂O₂ for 10 minutes. Cells are washed with ice-cold phosphate-buffered saline (PBS) once and fixed with prechilled methanol/acetone (7:3) at -20 °C for 10 minutes. After they are air-dried, plates are rehydrated with PBS and blocked using 5% nonfat dry milk in PBS-Tween(0.05%) (blocking solution) for 30 minutes at room temperature. Cells are incubated with anti-PAR antibody 10H (1:50) in blocking solution at room temperature for 60 minutes followed by washing with PBS-Tween20 five times, and incubation with goat antimouse 5(6)-isothiocyanate (FITC)-coupled antibody (1:50) and 1 μg/mL 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in blocking solution at room temperature for 60 minutes. After washing with PBS-Tween20 5 times, analysis is performed using an fmax Fluorescence Microplate Reader set at the excitation and emission wavelength for FITC or the excitation and emission wavelength for DAPI. PARP activity (FITC signal) is normalized with cell numbers (DAPI).

• Tiermodelle

  A 0.2 cc amount of a 1:10 dilution of tumor brei in 45% Matrigel and 45% Spinner MEM is injected subcutaneously into the flank of female SCID mice.

• Dosierungen

  12.5, 25, and 50 mg/kg/day, for 14 days

• Verabreichung

  Orally administrated