AM1241

Die Bindung an Cannabinoid-Rezeptoren wird mittels Kompetitions-Gleichgewichtsbindung gegen [³H]CP55,940 getestet. AM-1241 wird in 25 mM Tris-Base (pH 7,4)/5 mM MgCl₂/1 mM EDTA/0,1% im Wesentlichen fettsäurefreies BSA verdünnt und auf mit Regisil behandelte 96-Well-Platten überführt. [³H]CP55,940 (DuPont_NEN; spezifische Aktivität 100–180 Ci/mmol; 1 Ci = 37 GBq) wird bis zu einer Konzentration von 0,8 nM hinzugefügt. Membranen, die aus Rattenhirn (enthält CB1-Rezeptoren) oder Mausmilz (enthält CB2-Rezeptoren) präpariert wurden, werden hinzugefügt (ca. 50 μg Membranprotein pro Well), die Platten werden 1 Stunde bei 30 °C inkubiert, und der Inhalt wird über Packard Unifilter GF/B 96-Well-Filter unter Verwendung eines Packard Filtermate 196 Zellernteers filtriert. Die Filter werden mit eiskalter 50 mM Tris-Base/5 mM MgCl₂/0,5% BSA gewaschen und getrocknet. Die gebundene Radioaktivität wird quantifiziert und für die unspezifische Bindung korrigiert, und die Ergebnisse werden zwischen 0% und 100% spezifisch gebundenem [³H]CP-55,940 normalisiert. Der IC50-Wert wird durch nichtlineare Regressionsanalyse mittels GraphPad PRISM bestimmt und in einen Ki-Wert umgewandelt. Alle Daten werden doppelt erhoben. IC50- und Ki-Werte werden aus drei unabhängigen Experimenten bestimmt.

HEK cells and CHO cell lines stably express human CB2 receptor and CB1 receptor.

12 concentrations between 0.1 nM–10 μM

90 minutes

Membrane samples are prepared from HEK cells stably expressing the human CB2 receptors previously generated (Mukherjee et al., 2004), or the CHO cell line that stably expresses the human CB1 receptor. Radioligand binding assays are performed as following. Briefly, the cells are harvested and homogenized using a Polytron for 2 × 10 s bursts in a buffer containing 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM MgCl₂, and 1mM EDTA in the presence of protease inhibitors followed by centrifugation at 45 000 g for 20 minutes. The membrane pellets are washed and frozen at -80 °C in aliquots until use. Saturation binding reactions are performed at 30 °C for 90 minutes using [³H]CP 55,940 (0.01–8 nM) in an assay buffer containing 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2.5 mM EDTA, 5mM MgCl₂, and 0.05% fatty acid free bovine serum albumin (BSA) and the reactions are terminated by rapid vacuum filtration through UniFilter-96 GF/C filter plates and four washes with cold assay buffer. Competition experiments are conducted using 0.5 nM [³H]CP 55,940 in the presence of test compounds (0.1 nM–10 μM). Nonspecific binding is defined by 10 mM unlabeled CP 55,940. K_D values from saturation binding assays and Ki values from competition binding assays are determined with one site binding or one site competition curve fitting using the Prism software.

250-350 g male Sprague-Dawley rats

0, 100, 300, 1000, 3000 μg/kg

Administered via i.p.