AT9283

AT9283 führt zu einem klaren polyploiden Phänotyp, indem es die Aktivität der Aurora B Kinase in HCT116-Zellen mit einer IC50 von 30 nM hemmt. Darüber hinaus hemmt diese Verbindung auch die Koloniebildung von HCT116. [1]

Bei HCT116-Mäusen mit menschlichem Kolonkarzinom-Xenotransplantat führt die AT9283-Behandlung (15 mg/kg und 20 mg/kg) über 16 Tage zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums von 67 % bzw. 76 %. Darüber hinaus weist diese Verbindung auch eine signifikant längere Halbwertszeit in Tumoren (2,5 Stunden) im Vergleich zum Plasma (0,5 Stunden) und eine moderate orale Bioverfügbarkeit bei Mäusen (Fp.o. = 24 %) auf. [1]

• Aurora A- und Aurora B Kinase-Assays

  Assays für Aurora A und B werden im DELFIA-Format durchgeführt. Das Aurora A-Enzym wird mit AT9283 und 3 μM Cross-Tide-Substrat (Biotin-CGPKGPGRRGRRRTSSFAEG) in 10 mM MOPS, pH 7, 0,1 mg/mL BSA, 0,001 % Brij-35, 0,5 % Glycerin, 0,2 mM EDTA, 10 mM MgCl₂, 0,01 % β-Mercaptoethanol, 15 μM ATP und 2,5 % DMSO inkubiert. Das Aurora B-Enzym wird mit dieser Verbindung, 3 μM des oben genannten Substrats in 25 mM Tris, pH 8,5, 5 mM MgCl₂, 0,1 mg/mL BSA, 0,025 % Tween-20, 1 mM DTT, 15 μM ATP und 2,5 % DMSO inkubiert. Die Reaktionen werden 60 Minuten für Aurora A und 45-90 Minuten für Aurora B durchgeführt, bevor sie mit EDTA abgebrochen werden. Die Reaktionsgemische werden dann auf eine Neutravidin-beschichtete Platte übertragen, und das phosphorylierte Peptid wird mittels eines phospho-spezifischen Antikörpers und eines Europium-markierten sekundären Antikörpers unter Verwendung von zeitaufgelöster Fluoreszenz (Anregung, 337 nm; Emission, 620 nm) quantifiziert. Die IC50-Werte für die Kontrollverbindungen betragen 92 nM (Aurora A-Assay) und 17 nM (Aurora B).

• Zelllinien

  HCT 116 cells

• Konzentrationen

  1 nM - 10 μM

• Inkubationszeit

  72 hours

• Methode

  HCT 116 cells are cultured in DMEM + 10% FBS + GLUTAMAX I. Black 96-well flat-bottomed (clear) tissue culture treated plates are seeded in 200 μL of medium and incubated for approximately 16 hours at 37°C in a humidified atmosphere of 5% CO₂ in air. Cells are treated with test compound at nine different concentrations (spanning 1 nM to 10 μM, plus DMSO vehicle control) and then incubated for 72 hours. Polyploidy morphological observations of the cells are then noted. The concentration of AT9283 required to produce a distinct polyploid phenotype is reported. Cells are seeded at a concentration of 75−100 cells/mL relevant culture media onto 6- or 24-well tissue culture plates and allowed to recover for 16 hours. This compound (11 concentrations spanning 0.1 nM to 10 μM) or vehicle control (DMSO) is added to duplicate wells to give a final DMSO concentration of 0.1%. Following compound addition, colonies are allowed to grow between 10 and 14 days for optimum discrete colony counting. Colonies are fixed in 2 mL of Carnoys fixative (25% acetic acid, 75% MeOH) and stained in 2 mL of 0.4% w/v crystal violet. The numbers of colonies in each well is counted. IC50 values are calculated by sigmoidal dose-response (variable slope) IC50 curves using Prism Graphpad software.

• Tiermodelle

  HCT116 cells are injected s.c. Into the hind flank of male BALB/c mice.

• Dosierungen

  15 mg/kg and 20 mg/kg

• Verabreichung

  Administered via i.p.