AZD7762

AZD7762, ein selektiverer Chk1-Inhibitor, hemmt die Chk1-Phosphorylierung eines cdc25C-Peptids durch reversible Bindung an die ATP-Bindungsstelle von Chk1, mit einem IC50 von 5 nM und einem K_i von 3,6 nM. Diese Verbindung induziert einen Zellstopp mit einem EC50 von 0,620 μM und hebt den durch Camptothecin induzierten G2-Arrest mit einem EC50 von 10 nM signifikant auf, indem sie den Chk1-abhängigen Abbau von Cdc25A und die Aktivierung von Cyclin A blockiert. Es (300 nM) verstärkt die Antitumorwirksamkeit gegen SW620 und gegen MDA-MB-231 durch Reduzierung der GI50-Werte von 24,1 nM und 2,25 μM auf 1,08 nM bzw. 0,15 μM. [1] Diese Chemikalie zeigt Zytotoxizität gegen eine Vielzahl von Neuroblastom-Zelllinien, die p53 Wildtyp, p53-Mutation, Mdm2-Amplifikation oder p14-Deletion aufweisen, mit IC50-Werten im Bereich von 82,6-505,9 nM. [2]

AZD7762 allein bei 25 mg/kg zeigt wenig Antitumoraktivität in H460-DNp53-Xenograft-Mäusen und SW620-Xenograft-Mäusen, aber bei kombinierter Verabreichung zeigt diese Verbindung eine signifikante Antitumorwirksamkeit in den beiden Xenograft-Mäusen mit einem Log-Zelltod von 0,9 oder einem prozentualen behandelten/Kontroll-Verhältnis (%T/C) von 26 sogar bei niedriger Dosis von 12,5 mg. Die Dosis dieser Chemikalie in Kombination bei H460-DNp53-Xenograft-Ratten hemmt das Tumorvolumen dosisabhängig mit %T/C-Werten von 48 und 32 für 10 bzw. 20 mg/kg. Diese Verbindung (25 mg/kg) in Kombination führt zu einer vollständigen Tumorregression bei den SW620-Xenograft-Mäusen, wobei das %T/C signifikant auf -66% bzw. -67% ansteigt. [1]

• Chk1 Kinase-Assay

  Rekombinantes humanes Chk1 wird als S-Transferase-Fusion in Insektenzellen unter Verwendung eines Baculovirusvektors exprimiert und durch Affinitätschromatographie gereinigt. Ein synthetisches Peptidsubstrat (N-biotinylaminohexanoyl-KKVSRSGLYRSPMPENLNRPR) für Chk1 wird synthetisiert. Die Endkonzentrationen von Peptid und ATP (kalt + 40 nCi [³³P]ATP) betragen 0,8 bzw. 1 μM. Verschiedene Konzentrationen dieser Verbindung, Puffer, der Peptid und Chk1-Kinase enthält, und ATP werden sequentiell zu einer 384-Well-Assay-Platte gegeben. Die Platte wird 2 Stunden lang inkubiert, die Reaktion wird durch Zugabe von Puffer, der EDTA und Szintillationsnäherungs-Assay-Beads enthält, gestoppt und die Platten werden mit einem TopCount-Lesegerät abgelesen. Die Datenanalyse wird zur Bestimmung einer Dosis-Wirkungs-Beziehung (IC50) durchgeführt.

• Zelllinien

  HT29, SW620 and MDA-MB-231 cells

• Konzentrationen

  Dissolved in DMSO, final concentration ~12.5 μM

• Inkubationszeit

  20 or 48 hours

• Methode

  For the checkpoint abrogation assay, HT29 cells are treated for 2 hours with camptothecin (topoisomerase I inhibitor; 0.07 μg/mL) to induce the G2 checkpoint. Cells are then treated for 20 hours with a 12-point titration of AZD7762 (12.5 μM to 6 nM) plus nocodazole. Cells are fixed with 3.7% formaldehyde for 1 hour, permeabilized with PBS containing 0.05% Triton X, and incubated with anti-phH3 antibody for 1 hour followed by Alexa Fluor 488 anti-rabbit and Hoechst stain for 1 hour. Mitotic index is determined on the ArrayScan and expressed as the percentage of cells undergoing mitosis. For the potentiation assays, SW620 or MDA-MB-231 cells are dosed for 24 hours with a 9-point titration of ranging from 0.01 to 100 nM with a constant dose of this compound (300 nM). After 24 hours, medium is removed and this chemical alone is added back to the wells for an additional 24 hours. Cells are then incubated in this compound-free medium for an additional 72 hours. The effect on cell proliferation is determined by MTT.

• Tiermodelle

  Male NCr mice implanted s.c. with H460-DNp53 cells or SW620, and male rnu rats implanted s.c. with H460-DNp53 cells

• Dosierungen

  ~25 mg/kg

• Verabreichung

  Injection i.v.