Belinostat (PXD101)

Subkonfluente Kulturen werden geerntet und zweimal in eiskaltem PBS gewaschen und durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min pelletiert. Das Zellpellet wird in zwei Volumina Lysepuffer [60 mM Tris-Puffer (pH 7,4) mit 30 % Glycerin und 450 mM NaCl] resuspendiert und durch drei Gefrier- (Trockeneis) Tau- (30 °C Wasserbad) Zyklen lysiert. Zelltrümmer werden durch Zentrifugation bei 1,2 × 10⁴ g für 5 min entfernt, und der Überstand wird bei –80 °C gelagert. Histon-H4-Peptid (Sequenz SGRGKGGKGLGKGGAKRHRK, entsprechend den 20 NH2-terminalen Resten) wird durch ein rekombinantes Protein, das die Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Domäne von p300 enthält, unter Verwendung von [³H]-Acetyl-CoA als Acetatquelle acetyliert. H4-Peptid (100 μg) wird mit Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Puffer (50 mM Tris HCl pH 8,0, 5 % Glycerin, 50 mM KCl und 0,1 mM EDTA), 1 mM DTT, 1 mM 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid, 1 × kompletten Proteaseinhibitoren, 50 μL gereinigtem p300 und 1,85 m [³H]-Acetyl-CoA (4,50 Ci/mmol) in einem Endvolumen von 300 μL gemischt und bei 30 °C für 45 min inkubiert. Das p300-Protein wird durch Inkubation mit 20 μL 50 % Ni-Agarose-Beads für 1 Stunde bei 4 °C und Zentrifugation entfernt. Der Überstand wird auf eine 2 mL Sephadex G15-Säule aufgetragen, und der Durchfluss wird gesammelt. Ein Milliliter destilliertes H₂O wird vorsichtig aufgetragen, und drei Tropfenfraktionen werden gesammelt; dies wird wiederholt, bis 4–5 mL destilliertes H₂O hinzugefügt wurden und ~40 Fraktionen gesammelt werden. Drei Mikroliter jeder Fraktion werden in 2 mL Szintillationsflüssigkeit verdünnt und in einem Szintillationszähler gezählt, um die Fraktionen mit dem markierten Peptid zu identifizieren. Diese Fraktionen werden gepoolt, und 1 μL der kombinierten Probe wird gemessen, um die Radioaktivität in jeder Peptidcharge zu bestimmen (3-7×10³ cpm/μL). Für Aktivitätstests wird die Reaktion in einem Gesamtvolumen von 150 μL Puffer [60 mM Tris (pH 7,4) mit 30 % Glycerin] mit 2 μL Zellextrakt und, falls verwendet, 2 μL dieser Verbindung durchgeführt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 2 μL [³H]-markiertem Substrat (acetyliertes Histon-H4-Peptid, das den 20 NH₂-terminalen Resten entspricht) gestartet. Die Proben werden 45 min bei 37 °C inkubiert, und die Reaktion wird durch Zugabe von HCl und Essigsäure (Endkonzentrationen von 0,72 bzw. 0,12 M) gestoppt. Freigesetztes [³H]-Acetat wird in 750 μL Ethylacetat extrahiert, und die Proben werden bei 1,2 × 10⁴ g für 5 min zentrifugiert. Die obere Phase (600 μL) wird in 3 mL Szintillationsflüssigkeit überführt und gezählt.

A2780, A2780/cp70, 2780AD, HCT116, HT29, WIL, CALU-3, MCF7, PC3 and HS852

0.016 - 10 μM

24 hours

Tumor cell lines are seeded in 5 mL of medium at a density of 8 × 10⁴ cells/25 cm2 flask and incubated for 48 hours. Cells are exposed to Belinostat (0.016 to 10 μM) for 24 hours. The medium is removed, and 1 mL of trypsin/EDTA is added to each flask. Once the cells have detached, 1 mL of medium is added, the cells are resuspended, and those from the control untreated flask are counted. Cells are diluted and plated into 6-cm Petri dishes (three per flask) at a density of 0.5-2× 10³ cells/dish depending on the cell line. Cells from the drug-treated flasks are diluted and plated as for the control flasks. Dishes are incubated for 10–15 days at 37 °C. Cells are washed with PBS, fixed in methanol, and stained with crystal violet, and colonies that contained ≥50 cells counted. Sensitivity is expressed as the IC50 defined as the concentration of this compound required to reduce the number of colonies to 50% of that of the control untreated cells.

A2780, A2780/cp70 and HCT116 cells are injected s.c. into the right flank of CD1 nu/nu mice.

≤40 mg/kg

Administered via i.p.