Dovitinib (TKI-258)

Dovitinib (TKI-258) hemmt stark das FGF-stimulierte Wachstum von WT- und F384L-FGFR3-exprimierenden B9-Zellen mit einer IC50 von 25 nM. Darüber hinaus hemmt es die Proliferation von B9-Zellen, die jeweils die verschiedenen aktivierten Mutanten von FGFR3 exprimieren. Interessanterweise wurden minimale Unterschiede in der Empfindlichkeit der verschiedenen FGFR3-Mutationen gegenüber dieser Verbindung beobachtet, wobei die IC50 für jede der verschiedenen Mutationen zwischen 70 und 90 nM lag. IL-6-abhängige B9-Zellen, die nur Vektor enthalten (B9-MINV-Zellen), sind resistent gegenüber seiner hemmenden Aktivität bei Konzentrationen bis zu 1 μM. Es hemmt die Zellproliferation von KMS11 (FGFR3-Y373C), OPM2 (FGFR3-K650E) und KMS18 (FGFR3-G384D)-Zellen mit einer IC50 von 90 nM (KMS11 und OPM2) bzw. 550 nM. Die Verbindung hemmt die FGF-vermittelte ERK1/2-Phosphorylierung und induziert Zytotoxizität in FGFR3-exprimierenden primären MM-Zellen. BMSCs verleihen einen moderaten Grad an Resistenz mit 44,6 % Wachstumshemmung für Zellen, die mit 500 nM Dovitinib behandelt und auf Stroma kultiviert wurden, verglichen mit 71,6 % Wachstumshemmung für Zellen, die ohne BMSCs gezüchtet wurden. Es hemmt die Proliferation von M-NFS-60, einer M-CSF-Wachstums-gesteuerten murinen myeloblastischen Zelllinie mit einer mittleren effektiven Konzentration (EC50) von 220 nM. [1] Die Behandlung von SK-HEP1-Zellen mit dieser Verbindung führt zu einer dosisabhängigen Reduktion der Zellzahl und einem G2/M-Phasenarrest mit Reduktion der G0/G1- und S-Phasen, Hemmung des Verankerungs-unabhängigen Wachstums und Blockade der bFGF-induzierten Zellmotilität. Die IC50 dafür in SK-HEP1-Zellen beträgt ungefähr 1,7 μM. Es reduziert auch signifikant die basalen Phosphorylierungsniveaus von FGFR-1, FGFR substrate 2α (FRS2-α) und ERK1/2, aber nicht Akt in sowohl SK-HEP1- als auch 21-0208-Zellen. In 21-0208 HCC-Zellen hemmt es signifikant die bFGF-induzierte Phosphorylierung von FGFR-1, FRS2-α, ERK1/2, aber nicht Akt. [2]

Dovitinib (TKI-258) induziert in vivo sowohl zytostatische als auch zytotoxische Reaktionen, die zu einer Regression von FGFR3-exprimierenden Tumoren führen.[1] Es zeigt eine dosis- und expositionsabhängige Hemmung von Ziel-Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs), die in Tumorxenotransplantaten exprimiert werden. Diese Verbindung hemmt stark das Tumorwachstum von sechs HCC-Linien. Die Hemmung der Angiogenesis korrelierte mit der Inaktivierung der FGFR/PDGFRβ/VEGFR2-Signalwege. In einem orthotopen Modell hemmt es stark das primäre Tumorwachstum und die Lungenmetastasierung und verlängerte signifikant das Überleben der Mäuse. [2] Die Verabreichung von Dovitinib führt zu einer signifikanten Tumorwachstumshemmung und Tumorrückbildung, einschließlich großer, etablierter Tumoren (500-1.000 mm³). [3]

• In-vitro-Kinase-Assays

  Die 50%igen Hemmkonzentrationen (IC50-Werte) für die Hemmung von RTKs durch Dovitinib (TKI-258) werden in einem zeitaufgelösten Fluoreszenz- (TRF) oder radioaktiven Format bestimmt, indem die Hemmung der Phosphatübertragung auf ein Substrat durch das jeweilige Enzym gemessen wird. Die Kinase-Domänen von FGFR3, FGFR1, PDGFRβ und VEGFR1-3 werden in 50 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N^′-2-ethansulfonsäure), pH 7,0, 2 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂, 1 mM NaF, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA), 0,25 μM biotinyliertem Peptidsubstrat (GGGGQDGKDYIVLPI) und 1 bis 30 μM Adenosintriphosphat (ATP) in Abhängigkeit vom K_m für das jeweilige Enzym untersucht. Die ATP-Konzentrationen liegen bei oder knapp unter K_m. Für c-KIT- und FLT3-Reaktionen wird der pH-Wert auf 7,5 erhöht, mit 0,2 bis 8 μM ATP in Gegenwart von 0,25 bis 1 μM biotinyliertem Peptidsubstrat (GGLFDDPSYVNVQNL). Die Reaktionen werden bei Raumtemperatur 1 bis 4 Stunden inkubiert und das phosphorylierte Peptid auf Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten, die Stoppreaktionspuffer (25 mM EDTA [Ethylendiamintetraessigsäure], 50 mM HEPES, pH 7,5) enthalten, eingefangen. Phosphoryliertes Peptid wird mit dem DELFIA TRF-System unter Verwendung eines Europium-markierten Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers PT66 gemessen. Die Konzentration dieser Verbindung für IC50 wird mittels nichtlinearer Regression mit der XL-Fit-Datenanalysesoftware Version 4.1 (IDBS) berechnet. Die Hemmung der Kinaseaktivität des Kolonie-stimulierenden Faktor-1-Rezeptors (CSF-1R), PDGFRα, Insulinrezeptors (InsR) und Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktorrezeptors 1 (IGFR1) wird bei ATP-Konzentrationen nahe dem K_m für ATP bestimmt.

• Zelllinien

  B9 cells, MM cell lines

• Konzentrationen

  100 nM

• Inkubationszeit

  48-96 hours

• Methode

  Cell viability is assessed by 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyl tetrazolium (MTT) dye absorbance. Cells are seeded in 96-well plates at a density of 5 × 10³ (B9 cells) or 2 × 10⁴ (MM cell lines) cells per well. Cells are incubated with 30 ng/mL aFGF and 100 μg/mL heparin or 1% IL-6 where indicated and increasing concentrations of Dovitinib (TKI-258). For each concentration of this compound, 10 μL aliquots of drug or DMSO diluted in culture medium is added. To evaluate its effect on growth of MM cells adherent to BMSCs, 10⁴ KMS11 cells are cultured on BMSC-coated 96-well plates in the presence or absence of it. Plates are incubated for 48 to 96 hours. For assessment of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)-mediated growth, 5 × 10³ M-NFS-60 cells/well are incubated with serial dilutions of it with 10 ng/mL M-CSF and without granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). After 72 hours cell viability is determined using Cell Titer-Glo Assay. Each experimental condition is performed in triplicate.

• Tiermodelle

  8-week-old female BNX mice bearing KMS11 cells

• Dosierungen

  10, 30, or 60 mg/kg

• Verabreichung

  Gavage