CP-466722

Katalog-Nr.S2245 Charge:S224501

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Technische Daten

Formel

C₁₇H₁₅N₇O₂

Molekulargewicht

349.35

CAS-Nr.

1080622-86-1

Löslichkeit (25°C)*

In vitro

4-Methylpyridine (mit 50 °C warmem Wasserbad erwärmt)

5 mg/mL (14.31 mM)

DMSO

0.28 mg/mL (0.8 mM)

Water

Insoluble

In vivo (Lösungsmittel einzeln und der Reihe nach zum Produkt hinzufügen.)

Clear solution

5%4-Methylpyridine 1 40%PEG300 2 5%Tween80 3 50%ddH2O

Validiert von Selleck Labs. Sollten Sie Anpassungen an dieser Formulierung benötigen, wenden Sie sich an unser Vertriebsteam für kundenspezifische Tests.

0.1mg/ml (0.29mM)

Taking the 1 mL working solution as an example, add 50 μL of 2 mg/ml clarified 4-Methylpyridine stock solution to 400 μL of PEG300, mix evenly to clarify it; add 50 μL of Tween80 to the above system, mix evenly to clarify; then continue to add 500 μL of ddH2O to adjust the volume to 1 mL. The mixed solution should be used immediately for optimal results.

* <1 mg/ml bedeutet schwer löslich oder unlöslich.
* Bitte beachten Sie, dass Selleck die Löslichkeit aller Verbindungen intern testet und die tatsächliche Löslichkeit geringfügig von veröffentlichten Werten abweichen kann. Dies ist normal und ist auf geringfügige Batch-zu-Batch-Variationen zurückzuführen.
* Versand bei Raumtemperatur (Stabilitätstests zeigen, dass dieses Produkt ohne Kühlmaßnahmen versendet werden kann.)

Vorbereitung von Stammlösungen

Biologische Aktivität

Beschreibung

CP-466722 ist ein potenter und reversibler ATM-Inhibitor, der ATR nicht beeinflusst und PI3K- oder PIKK-Familienmitglieder in Zellen hemmt.

Ziele

ATM

410 nM

In vitro

In vitro wird CP-466722 als potenzieller Inhibitor identifiziert, der die Aktivität der gereinigten ATM-Kinase zur Phosphorylierung des GST-p53(1–101)-Substrats verringert. Darüber hinaus zeigt diese Verbindung auch hemmende Aktivitäten gegen abl- und src-Kinasen. In HeLa-Zellen führt diese Verbindung in Dosen von 6 μM zu einer Hemmung der ATM-abhängigen Phosphorylierung durch reversible Hemmung der durch ionisierende Strahlung (IR) induzierten ATM-Kinase-Aktivität. Außerdem wird die ATM-abhängige p53-Induktion durch diese Chemikalie in MCF-7-Brustkrebszellen des Menschen sowie in primären und immortalisierten diploiden menschlichen Fibroblasten gehemmt. Als Reaktion auf IR erhöht diese Verbindung den Anteil der Zellen mit G2/M-DNA-Gehalt und reduziert den Anteil der Zellen mit G1-Phasen-DNA-Gehalt in HeLa-Zellen. Eine kurzzeitige Exposition gegenüber dieser Chemikalie für einen Zeitraum von 4 Stunden sensibilisiert HeLa-Zellen für IR, ohne die Zellplattierung oder die Zellviabilität zu beeinflussen.

Protokoll (aus Referenz)

Kinase-Assay:^{^[1]}	In-vitro-Kinase-Assays Um Kleinmolekül-Inhibitoren der ATM-Kinase-Aktivität zu screenen, wird ein In-vitro-Kinase-Assay adaptiert und ein ELISA-Assay entwickelt, der den Phosphorylierungsstatus des ATM-Downstream-Ziels p53 misst. Rekombinantes GST-p53(1-101) und Volllängen-Flag-markiertes ATM & ATR werden gereinigt, um in den ELISA- und In-vitro-Kinase-Assays verwendet zu werden. Kurz gesagt, Nunc 96-Well Maxisorp-Platten werden über Nacht (4 °C) mit 2 μg gereinigtem, rekombinantem GST-p53(1-101) in PBS beschichtet. Alle nachfolgenden Inkubationen werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Platten werden (0,05 % v/v-Tween/PBS) gewaschen, bevor gereinigte rekombinante Volllängen-ATM-Kinase (30 ng–60 ng) in einem Endvolumen von 80 μL Reaktionspuffer (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂, 1 mM DTT und 1 μM ATP) in Anwesenheit oder Abwesenheit von CP-466722 hinzugefügt wird. Diese Verbindung (10 μM) wird den Platten in Duplikaten zugesetzt und der Kinase-Assay wird (90 Minuten) inkubiert. Die Platten werden (0,05 % v/v-Tween/PBS) gewaschen, blockiert (1 Stunde, 1 % w/v-BSA/PBS) und gespült, bevor Anti-Phospho(Ser15)-p53-Antikörper (1:1000/PBS) zu den Platten gegeben und (1 Stunde) inkubiert wird. Um unspezifische Bindung zu reduzieren, werden die Platten (0,05 % v/v-Tween/PBS) gewaschen, bevor (1 Stunde) mit HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (1:5000/PBS) inkubiert wird. Sekundärantikörper, der an das phosphorylierte GST-p53(1–101)-Protein gebunden ist, wird mit TMB-Substrat-Reagenz detektiert. Die Platten werden (15 Minuten–30 Minuten) entwickelt und die Reaktion wird (1 M H₂SO₄ Endkonzentration) gestoppt, bevor die Absorption bestimmt wird (λ450nm). Diese Verbindung, die die ATM-Kinase-Aktivität in ELISA-Assays hemmt, wird hinsichtlich der Hemmung von ATM/ATR-Kinasen unter Verwendung von In-vitro-Kinase-Assays charakterisiert. Western Blotting unter Verwendung des Anti-Phospho(Ser15)-p53-Antikörpers wird als Ablesewert der ATM/ATR-Hemmung verwendet. Eine erweiterte Analyse dieser Chemikalie (10 μM) gegen ein kommerziell erhältliches Kinase-Panel wird von Upstate durchgeführt.
Zell-Assay:^{^[1]}	Zelllinien HeLa and A-T Konzentrationen 0-6 μM Inkubationszeit 4 hours Methode HeLa or A-T (GM02052 expressing hTERT) cells are plated in triplicate and incubated for 24 hours. Cells are pre-treated: DMSO, CP466722 or KU55933 prior to IR (0-10Gy). Cells are incubated for 4 hours following IR before media is removed, cells washed (PBS), trypsined, counted and re-plated (2000 cells/plate, 10 cm plates) in the absence of this compound and incubated for 10 days. Prior to colony counting, cells are washed (PBS), stained (PBS, 0.0037%v/v-formaldehyde, 0.1%w/v-crystal violet), rinsed (dH₂O) and dried. Defined populations (>50 cells) are counted as one surviving colony, data are calculated as percentage surviving colonies relative to control plates +/− SE.

Kinase-Assay:^{^[1]}

In-vitro-Kinase-Assays
Um Kleinmolekül-Inhibitoren der ATM-Kinase-Aktivität zu screenen, wird ein In-vitro-Kinase-Assay adaptiert und ein ELISA-Assay entwickelt, der den Phosphorylierungsstatus des ATM-Downstream-Ziels p53 misst. Rekombinantes GST-p53(1-101) und Volllängen-Flag-markiertes ATM & ATR werden gereinigt, um in den ELISA- und In-vitro-Kinase-Assays verwendet zu werden. Kurz gesagt, Nunc 96-Well Maxisorp-Platten werden über Nacht (4 °C) mit 2 μg gereinigtem, rekombinantem GST-p53(1-101) in PBS beschichtet. Alle nachfolgenden Inkubationen werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Platten werden (0,05 % v/v-Tween/PBS) gewaschen, bevor gereinigte rekombinante Volllängen-ATM-Kinase (30 ng–60 ng) in einem Endvolumen von 80 μL Reaktionspuffer (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂, 1 mM DTT und 1 μM ATP) in Anwesenheit oder Abwesenheit von CP-466722 hinzugefügt wird. Diese Verbindung (10 μM) wird den Platten in Duplikaten zugesetzt und der Kinase-Assay wird (90 Minuten) inkubiert. Die Platten werden (0,05 % v/v-Tween/PBS) gewaschen, blockiert (1 Stunde, 1 % w/v-BSA/PBS) und gespült, bevor Anti-Phospho(Ser15)-p53-Antikörper (1:1000/PBS) zu den Platten gegeben und (1 Stunde) inkubiert wird. Um unspezifische Bindung zu reduzieren, werden die Platten (0,05 % v/v-Tween/PBS) gewaschen, bevor (1 Stunde) mit HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (1:5000/PBS) inkubiert wird. Sekundärantikörper, der an das phosphorylierte GST-p53(1–101)-Protein gebunden ist, wird mit TMB-Substrat-Reagenz detektiert. Die Platten werden (15 Minuten–30 Minuten) entwickelt und die Reaktion wird (1 M H₂SO₄ Endkonzentration) gestoppt, bevor die Absorption bestimmt wird (λ450nm). Diese Verbindung, die die ATM-Kinase-Aktivität in ELISA-Assays hemmt, wird hinsichtlich der Hemmung von ATM/ATR-Kinasen unter Verwendung von In-vitro-Kinase-Assays charakterisiert. Western Blotting unter Verwendung des Anti-Phospho(Ser15)-p53-Antikörpers wird als Ablesewert der ATM/ATR-Hemmung verwendet. Eine erweiterte Analyse dieser Chemikalie (10 μM) gegen ein kommerziell erhältliches Kinase-Panel wird von Upstate durchgeführt.

Zell-Assay:^{^[1]}

Zelllinien
HeLa and A-T
Konzentrationen
0-6 μM
Inkubationszeit
4 hours
Methode
HeLa or A-T (GM02052 expressing hTERT) cells are plated in triplicate and incubated for 24 hours. Cells are pre-treated: DMSO, CP466722 or KU55933 prior to IR (0-10Gy). Cells are incubated for 4 hours following IR before media is removed, cells washed (PBS), trypsined, counted and re-plated (2000 cells/plate, 10 cm plates) in the absence of this compound and incubated for 10 days. Prior to colony counting, cells are washed (PBS), stained (PBS, 0.0037%v/v-formaldehyde, 0.1%w/v-crystal violet), rinsed (dH₂O) and dried. Defined populations (>50 cells) are counted as one surviving colony, data are calculated as percentage surviving colonies relative to control plates +/− SE.

Referenzen

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18794134/
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24464432/

Kundenproduktvalidierung

: Daten von [ PLoS One , 2012 , 7(11), e50423 ]

: Daten von [ PLoS One , 2012 , 7(11), e50423 ]

: Daten von [ J Neurooncol , 2012 , 110(3), 349-57 ]

: Daten von [ J Neurooncol , 2012 , 110(3), 349-57 ]

Sellecks CP-466722 Wurde zitiert von 11 Publikationen

Loss of N-Glycanase 1 Alters Transcriptional and Translational Regulation in K562 Cell Lines [ G3 (Bethesda), 2020, 4;10(5):1585-1597]	PubMed: 32265286
Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. [ Cell, 2019, 36(2):179-193]	PubMed: 28162770
A Pharmacogenomic Landscape in Human Liver Cancers. [ Cancer Cell, 2019, 36(2):179-193]	PubMed: 31378681
An Anticancer Drug Cocktail of Three Kinase Inhibitors Improved Response to a Dendritic Cell-Based Cancer Vaccine [ Cancer Immunol Res, 2019, 7(9):1523-1534]	PubMed: 31266784
Upregulation of long noncoding RNA SNHG20 promotes cell growth and metastasis in esophageal squamous cell carcinoma via modulating ATM-JAK-PD-L1 pathway [ J Cell Biochem, 2019, 10.1002/jcb.28444]	PubMed: 30767270
Alleviation of Senescence via ATM Inhibition in Accelerated Aging Models. [ Mol Cells, 2019, 42(3):210-217]	PubMed: 30726661
ATM‑JAK‑PD‑L1 signaling pathway inhibition decreases EMT and metastasis of androgen‑independent prostate cancer. [ Mol Med Rep, 2018, 17(5):7045-7054]	PubMed: 29568923
Simultaneous targeting of ATM and Mcl-1 increases cisplatin sensitivity of cisplatin-resistant non-small cell lung cancer [ Cancer Biol Ther, 2017, 18(8):606-615]	PubMed: 28686074
Monitoring the Activation of the DNA Damage Response Pathway in a 3D Spheroid Model. [Mondesert O, et al. PLoS One, 2015, 10(7):e0134411]	PubMed: 26225756
ATM inhibitor KU-55933 increases the TMZ responsiveness of only inherently TMZ sensitive GBM cells. [Nadkarni A, et al. J Neurooncol, 2012, 110(3):349-57]	PubMed: 23054561

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