CP-724714

CP-724,714 ist selektiv gegen EGFR mit einer IC50 von 6,4 μM markiert. CP-724,714 ist >1.000-fach weniger potent für IR, IGF-1R, PDGFRβ, VGFR2, abl. Src, c-Met c-jun NH2-terminale Kinase (JNK)-2, JNK-3, ZAP-70, Cyclin-abhängige Kinase (CDK)-2 und CDK-5. CP-724,714 reduziert potent die EGF-induzierte Autophosphorylierung der Chimäre, die die erbB2-Kinasedomäne enthält, mit einer IC50 von 32 nM, ist aber in transfizierten NIH3T3-Zellen deutlich weniger potent gegen EGFR. CP-724,714 hemmt empfindlich die Proliferation von erbB2-amplifizierten Zellen, einschließlich BT-474 und SKBR3, mit einer IC50 von 0,25 und 0,95 μM. CP-724,714 induziert die Akkumulation von Zellen in der G1-Phase und eine deutliche Reduktion der S-Phase in BT-474-Zellen bei 1 μM. [1] CP-724,714 übt seine Hepatotoxizität wahrscheinlich sowohl über hepatozelluläre Schäden als auch über hepatobiliäre cholestatische Mechanismen aus. CP-724,714 zeigt eine Hemmung des Cholyl-Lysyl- und Taurocholat (TC)-Efflux in Canaliculi in kryokonservierten bzw. frisch kultivierten menschlichen Hepatozyten. CP-724,714 hemmt den TC-Transport in Membranvesikeln, die die humane Gallensalz-Exportpumpe exprimieren, mit einer IC50 von 16 μM und hemmt den Haupt-Efflux-Transporter in Gallengangskanälchen, MDR1, mit einer IC50 von ~28 μM. [2]

CP-724,714 (25 mg/kg) wird nach p.o. Verabreichung schnell resorbiert und bewirkt eine Reduktion der Phosphorylierung des Tumor-erbB2-Rezeptors nach Dosisgabe in FRE-erbB2- oder BT-474-Xenotransplantaten. CP-724,714 induziert Apoptose in FRE-erbB2-Xenotransplantat-tragenden (s.c.) Mäusen und zeigt eine 50%ige Hemmung des Tumorwachstums bei 50 mg/kg, ohne Gewichtsverlust oder Mortalität. CP-724,714 zeigt auch eine große Antitumoraktivität in MDA-MB-453-, MDA-MB-231-, LoVo (Kolon)- und Colo-205 (Kolon)-Xenotransplantaten. Darüber hinaus reduziert CP-724,714 (30 oder 100 mg/kg) die extrazelluläre Signal-regulierte Kinase- und Akt-Phosphorylierung in BT-474-Xenotransplantaten. [1]

• Kinase-Assays

  Rekombinante intrazelluläre Domänen von erbB2 (Aminosäurereste 675-1255) und EGFR (Aminosäurereste 668-1211) werden in Baculovirus-infizierten Sf9-Zellen als S-Transferase-Fusionsproteine exprimiert. Die Proteine werden durch Affinitätschromatographie an Sepharose-Kügelchen für den Einsatz im Assay gereinigt. Nunc MaxiSorp 96-Well-Platten werden durch Inkubation über Nacht bei 37 °C mit 100 μL/Well von 0,25 mg/mL Poly(Glu:Tyr, 4:1), PGT in PBS beschichtet. Überschüssiges PGT wird durch Absaugen entfernt und die Platte 3 Mal mit Waschpuffer (0,1 % Tween 20 in PBS) gewaschen. Die Kinase-Reaktion wird in 50 μL von 50 mm HEPES (pH 7,4) durchgeführt, das 125 mm Natriumchlorid, 0,1 mm Natriumorthovanadat, 1 mm ATP und ~15 ng rekombinantes Protein enthält. Inhibitoren in DMSO werden zugegeben; die endgültige DMSO-Konzentration beträgt 2,5 %. Die Phosphorylierung wird durch Zugabe von ATP initiiert und 6 min lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln fortgesetzt. Die Kinase-Reaktion wird durch Absaugen des Reaktionsgemisches und viermaliges Waschen mit Waschpuffer beendet. Phosphoryliertes PGT wird nach einer 25-minütigen Inkubation mit 50 μL/Well HRP-konjugiertem PY54 Anti-Phosphotyrosin-Antikörper gemessen, verdünnt auf 0,2 μg/mL in Blockierpuffer (3 % BSA, 0,05 % Tween 20 in PBS). Der Antikörper wird durch Absaugen entfernt und die Platte viermal mit Waschpuffer gewaschen. Das kolorimetrische Signal wird durch Zugabe von 50 μL/Well Tetramethylbenzidin Microwell Peroxidase-Substrat entwickelt und durch Zugabe von 50 μL/Well 0,09 m Schwefelsäure gestoppt. Das gebildete Phosphotyrosin-Produkt wird durch Messung der Absorption bei 450 nm geschätzt. Das Signal für die Kontrollen liegt typischerweise bei A0,6–1,2, mit im Wesentlichen keinem Hintergrund in Wells ohne ATP, Kinaseprotein oder PGT, und ist proportional zur Inkubationszeit von 6 min.

• Zelllinien

  ZR-75-30, HCC-1419, MDA-MB-175, BT-474, SKBR3, MDA-MB-361, UACC-812, T-47D, MDA-MB-453, MDA-MB-468, CAMA-1, MDA-MB-157, MCF-7, MDA-MB-435, ZR-75-1, BT-20, and MDA-MB-231.

• Konzentrationen

  0.1 nM - 10 μM.

• Inkubationszeit

  6 to 7 days.

• Methode

  Cells are seeded in duplicate at 5~10 × 10³ per well in 24-well plates. The day after plating, CP-724,714 is added by titrating over six or more dilutions from 0.1 nM to 10 μM. Control wells without CP-724,714 are seeded as well. Cells are grown for 6 to 7 days, at which time surviving cells are counted. After trypsinization, cells are placed in isotone solution and counted immediately using a Coulter Z2 particle counter. Growth inhibition is calculated [(1− experimental value / control value) × 100] for each concentration. Dose-response curves are repeated at least twice and averaged. IC50 values are calculated using Calcusyn Software.

• Tiermodelle

  FRE-erbB2 BT-474, MDA-MB-453, MDA-MB-231, LoVo (colon), and Colo-205 (colon) xenografts are established in athymic female mice (CD-1 nu/nu).

• Dosierungen

  ~100 mg/kg.

• Verabreichung

  Administered via p.o.