Flavopiridol (Alvocidib, HMR-1275)

Für den CDK1/Cyclin B1-Kinase-Assay bestehen die Kinase-Reaktionen aus 100 ng des im Baculovirus exprimierten GST-CDK1/Cyclin B1 (human)-Komplexes, 1 μg Histon HI, 0,2 μCi [γ-³³P]ATP, 25 μM ATP in 50 μL Kinase-Puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 0,5 mM DTT). Für den CDK2/Cyclin E-Kinase-Assay bestehen die Kinase-Reaktionen aus 5 ng des im Baculovirus exprimierten GST-CDK2/Cyclin E (human)-Komplexes, 0,5 μg GST-RB-Fusionsprotein (Aminosäuren 776-928 des Retinoblastom-Proteins), 0,2 μCi [γ-³³P]ATP, 25 μM ATP in 50 μL Kinase-Puffer (50 mM Hepes, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM DTT). Für den CDK4/Cyclin D1-Kinase-Assay bestehen die Kinase-Reaktionen aus 150 ng des im Baculovirus exprimierten GST-CDK4/Cyclin D1 (human), 280 ng Stag-Cyclin D1, 0,5 μg GST-RB-Fusionsprotein (Aminosäuren 776-928 des Retinoblastom-Proteins), 0,2 μCi [γ-³³P]ATP, 25 μM ATP in 50 μL Kinase-Puffer (50 mM Hepes, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM DTT). Die Reaktionen werden 45 Minuten für CDK1 und CDK2 oder 1 Stunde für CDK4 bei 30 °C inkubiert und durch Zugabe von kalter Trichloressigsäure (TCA) bis zu einer Endkonzentration von 15 % gestoppt. TCA-Präzipitate werden auf GF/C-Unifilterplatten mit einem Filtermate Universal Harvester gesammelt und die Filter mit einem TopCount 96-Well Flüssigkeitsszintillationszähler quantifiziert. Flavopiridol (Alvocidib) wird in 10 mM in Dimethylformamid (DMF) gelöst und in sechs Konzentrationen, jeweils dreifach, evaluiert. Die Endkonzentration von DMF im Assay beträgt 2 %. Die IC50-Werte werden durch nichtlineare Regressionsanalyse abgeleitet und haben einen Variabilitätskoeffizienten von 16 %. Zur Bestimmung seiner Aktivität auf CDK6 wird ein Filterbindungsassay etabliert. Die folgenden Komponenten werden in der Reaktionsmischung kombiniert: 2 μL CDK6 (0,7 mg/μL), 5 μL Histon H1 (6 mg/mL), 14 μL Kinase-Puffer (60 mM β-Glycerophosphat, 30 mM p-Nitrophenylphosphat, 25 mM MOPS (pH 7,0), 5 mM EGTA, 15 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,1 mM Na-Vanadat), 3 μL zunehmender Konzentrationen dieser in 50 % DMSO verdünnten Verbindung und 6 μL ³³P-ATP (1 mCi/mL) in nichtradioaktivem ATP bei 90 μM Konzentration (Endkonzentration: 15 μM). Der Assay wird durch Zugabe von ³³P-ATP initiiert. Die Reaktion wird 20 Minuten bei 30 °C inkubiert. Ein 25 μL Aliquot des Überstands wird dann auf Whatman P81 Phosphocellulose-Papier aufgetragen. Die Filter werden 5 Mal mit 1 %iger Phosphorsäurelösung gewaschen. Feuchte Filter werden in Gegenwart von 1 mL Szintillationsflüssigkeit gezählt. Die Cdk9-Aktivität wird unter Verwendung von 50 nM rekombinantem Cdk9/Cyclin T in 50 mM HEPES pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, 150 μM RNA-Polymerase CDT-Peptid und 80 μM ATP gemessen. Der Cdk7-Assay wird im selben Puffer unter Verwendung von 37 nM gereinigter Kinase in Gegenwart von 200 μM ATP und 10 μM Myelin-Bindungsprotein als Substrat durchgeführt. Die Wirksamkeit gegenüber CDK9 und CDK7 wird entweder mittels eines starken Anionenaustauscher-(Dowex 1-X8 Harz, Formiat-Form)-basierten Assays oder eines Szintillationsproximity-Assays bestimmt. Die IC50-Werte werden aus den Dosis-Wirkungs-Kurven berechnet.

MCF-7, LNCAP, PC3, HCT116, CACO-2, A549, HL60, K562 cells and et al.

Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

72 hours

Cells are exposed to various concentrations of Flavopiridol (Alvocidib) for 72 hours, at which time the tetrazolium dye, MTS in combination with phenazine methosulfate, is added. After 3 hours, the absorbency is measured at 492 nm, which is proportional to the number of viable cells. The results are expressed as IC50 values. For cell cycle analysis, cells are fixed in paraformaldehyde and ethanol, washed, resuspended in a staining solution of TdT enzyme and FITC-dUTP, washed, stained with PI following RNase treatment, and then analyzed by flow cytometry.

Female Balb/c×DBA/2J F1 mice inoculated ip with P388 ascites leukemic cells, and Balb/c nu/nu nude mice subcutaneous implanted with A2780, Br-cycE, or A431 cells

~7.5 mg/kg/day

Injection i.p.