Ispinesib (SB-715992)

Ispinesib (SB-715992) ist ein potenter, allosterischer, reversibler und spezifischer Inhibitor von KSP, der die Bindungseigenschaft von KSP an Mikrotubuli verändert und deren Bewegung stört, indem er die ADP-Freisetzung hemmt, ohne die Freisetzung des KSP-ADP-Komplexes aus den Mikrotubuli zu verändern. [1] Diese Verbindung zeigt potente zytotoxische Aktivität in einer Reihe von Tumorzelllinien, einschließlich Colo205, Colo201, HT-29, M5076, Madison-109 und MX-1, mit IC50-Werten von 1,2 nM bis 9,5 nM. [2] In PC-3-Prostatakrebszellen blockiert es (15 nM und 30 nM) die Zellproliferation und induziert Apoptose durch die Regulierung der Expressionsniveaus von Genen, die Apoptose, Zellproliferation, Zellzyklus und Zellsignalisierung steuern, wie EGFR, p27, p15 und IL-11. [3] In einer Reihe von 53 Brustzelllinien zeigt Ispinesib (7,4 nM–600 nM) eine breite hemmende Aktivität. In BT-474- und MDA-MB-468-Zellen induziert es (150 nM) Apoptose, wie durch einen höheren Anteil apoptotischer Zellen, einen niedrigeren antiapoptotischen Bcl-X_L-Spiegel und höhere proapoptotische Bax- und Bid-Spiegel offenbart wird. [4]

Ispinesib (SB-715992) (4,5 mg/kg–15 mg/kg) zeigt hemmende Wirkungen gegen Colo205, Colo201, HT-29, aber nicht gegen MX-1-Zellen in Maus-Xenograft-Modellen. Diese Verbindung (6 mg/kg–10 mg/kg) hemmt auch murine solide Tumoren, einschließlich Madison 109 Lungenkarzinom, M5076-Sarkom sowie L1210- und P388-Leukämien. [2] In Maus-Xenograft-Modellen von Brustkrebszellen MCF-7, HCC1954, MDA-MB-468 und KPL4 hemmt es (8 mg/kg–10 mg/kg) das Tumorwachstum. [4]

• Kinetische Analyse der ATPase-Aktivität von humanem KSP im Steady-State und Hemmung durch Ispinesib

  Die Kinesin-Spezifitätsanalyse wird unter Verwendung eines Pyruvatkinase-Laktatdehydrogenase-Nachweissystems durchgeführt, das die Produktion von ADP mit der Oxidation von NADH koppelt. Änderungen der Absorption werden bei 340 nm überwacht. Steady-State-Studien mit nanomolaren Konzentrationen von KSP werden unter Verwendung eines empfindlichen fluoreszenzbasierten Assays durchgeführt, der ein Pyruvatkinase-, Pyruvatoxidase- und Meerrettichperoxidase (HRP)-gekoppeltes Nachweissystem nutzt, das die Generierung von ADP mit der Oxidation von Amplex Red zu fluoreszierendem Resorufin koppelt. Die Generierung von Resorufin wird durch Fluoreszenz überwacht (λ_Anregung = 520 nm und λ_Emission = 580 nm). Biochemische Steady-State-Experimente werden in PEM25-Puffer [25 mM Pipes-K⁺ (pH 6,8), 2 mM MgCl₂, 1 mM EGTA] für Experimente mit Mikrotubuli durchgeführt. Der IC50 für die Steady-State-Hemmung wird bei 500 µM ATP, 5 µM Mikrotubuli und 1 nM KSP in PEM25-Puffer bestimmt. K_{i app} (scheinbare Inhibitor-Dissoziationskonstante)-Werte von Ispinesib (SB-715992) werden aus den Dosis-Wirkungs-Kurven extrahiert, mit expliziter Korrektur für die Enzymkonzentration unter Verwendung der Morrison-Gleichung. Die Inhibitor-Modalität (z. B. kompetitiv, nicht-kompetitiv, unkompetitiv oder gemischt) unter Steady-State-Bedingungen wird durch Messung des Effekts seiner Konzentration auf die Anfangsgeschwindigkeit als Funktion der Substratkonzentrationen bestimmt. Die Daten werden unter Verwendung von Gleichungen in GraFit an Geschwindigkeitsgleichungen für die verschiedenen Hemmungsmodi angepasst.

• Zelllinien

  Breast cancer cells, including MCF-7, HCC1954, MDA-MB-468, and KPL4

• Konzentrationen

  0.085 nM–33 µM

• Inkubationszeit

  72 hours

• Methode

  After plating cells in log phase of growth in 96-well plates and treating them with Ispinesib (SB-715992) for 72 hours, cell growth is measured using CellTiter-Glo, and luminescence is detected using BioTek FLx800. Data are analyzed and the IC50 value, defined as the drug concentration that results in 50% growth inhibition relative to control, is calculated.

• Tiermodelle

  Nude (nu/nu) mice models of MCF7, KPL4, and HCC1954 cells; severe combined immunodeficient (SCID) mice model of MDA-MB-468 cells;

• Dosierungen

  10 mg/kg for nude mice or 8 mg/kg for SCID mice

• Verabreichung

  Intraperitoneal injection on a q4d× schedule (3 doses, every 4 day