KU-0063794

Verglichen mit dem mTOR-Inhibitor PP242 zeigt KU-0063794 eine höhere Spezifität für mTOR, da es inaktiv gegenüber PI3Ks oder 76 anderen Kinasen ist. In HEK-293-Zellen ist diese Verbindung bei 30 nM ausreichend, um die S6K1-Aktivität durch Blockierung der Phosphorylierung des hydrophoben Motivs (Thr³⁸⁹) und anschließend der Phosphorylierung des T-Loop-Rests (Thr²²⁹) schnell zu unterbinden. Bei IGF1-Stimulation von Serum-gehungerten HEK-293-Zellen sind 300 nM dieser Verbindung erforderlich, um die S6K1-Aktivität um ~90% zu hemmen. Diese Chemikalie bei 100-300 nM hemmt auch vollständig die Aminosäure-induzierte Phosphorylierung von S6K1 und S6-Protein. Ähnlich wie S6K1 hemmt sie die Phosphorylierung von mTORC1 an Ser²⁴⁴⁸ und mTORC2 an Ser²⁴⁸¹ dosis- und zeitabhängig. In Anwesenheit von Serum oder nach IGF1-Stimulation induziert diese Verbindung eine dosisabhängige Hemmung der Aktivität und Phosphorylierung von Akt an Ser⁴⁷³ und unerwarteter Thr³⁰⁸ sowie der Phosphorylierung der Akt-Substrate PRAS40 an Thr²⁴⁶, GSK3α/GSK3β an Ser²¹/Ser⁹ und Foxo-1/3a an Thr²⁴/Thr³². Diese Verbindung, aber nicht Rapamycin, hemmt die SGK1-Aktivität und die Ser⁴²²-Phosphorylierung sowie ihr physiologisches Substrat NDGR1 dosisabhängig, im gleichen Maße wie die S6K1- und Akt-Phosphorylierung, wohingegen sie die Phorbolester-induzierte ERK- oder RSK-Phosphorylierung und RSK-Aktivierung nicht hemmt. Verglichen mit Rapamycin zeigt diese Chemikalie eine signifikantere Potenz, die vollständige Dephosphorylierung von 4E-BP1 an Thr³⁷, Thr⁴⁶ und Ser⁶⁵ zu induzieren. Sie hemmt das Zellwachstum sowohl von Wildtyp- als auch von mLST8-defizienten MEFs und induziert einen G1-Zellzyklusarrest, signifikanter als Rapamycin. [1]

Ku0063794 hemmt das Tumorwachstum und die mTOR-Signalübertragung in einem präklinischen Nierenzellkarzinommodell. Diese Verbindung war jedoch in der Tierstudie nicht wirksamer. Eine mögliche Erklärung für das Fehlen einer größeren Aktivität in vivo für diese Chemikalie[2].

• mTOR-Komplex-Kinase-Assays

  HEK-293-Zellen werden frisch in Hepes-Lysepuffer lysiert. Lysat (1-4 mg) wird durch Inkubation mit 5-20 μL Protein G-Sepharose, konjugiert an präimmunes IgG, vorklärt. Die Lysatextrakte werden dann mit 5-20 μL Protein G-Sepharose, konjugiert an 5-20 μg entweder Anti-Rictor- oder Anti-Raptor-Antikörper, oder präimmunes IgG, inkubiert. Alle Antikörper sind kovalent an Protein G-Sepharose konjugiert. Immunpräzipitationen werden 1 Stunde lang bei 4 °C auf einer Vibrationsplattform durchgeführt. Die Immunpräzipitate werden viermal mit Hepes-Lysepuffer gewaschen, gefolgt von zwei Waschschritten mit Hepes-Kinasepuffer. Für Raptor-Immunpräzipitate, die zur Phosphorylierung von S6K1 verwendet werden, enthält der Puffer für die ersten beiden Waschschritte 0,5 M NaCl, um eine optimale Kinaseaktivität zu gewährleisten. GST-Akt1 wird aus serumdeprivierten HEK-293-Zellen isoliert, die mit PI-103 (1 μM für 1 Stunde) inkubiert wurden. GST-S6K1 wird aus serumdeprivierten HEK-293-Zellen gereinigt, die mit Rapamycin (0,1 μM für 1 Stunde) inkubiert wurden. mTOR-Reaktionen werden durch Zugabe von 0,1 mM ATP und 10 mM MgCl₂ in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von KU-0063794 und GST-Akt1 (0,5 μg) oder GST-S6K1 (0,5 μg) initiiert. Die Reaktionen werden 30 Minuten lang bei 30 °C auf einer Vibrationsplattform durchgeführt und durch Zugabe von SDS-Probenpuffer gestoppt. Reaktionsmischungen werden dann durch einen 0,22-μm-Porenfilter von Spin-X filtriert und Proben werden der Elektrophorese und Immunoblot-Analyse mit den angegebenen Antikörpern unterzogen.

• Zelllinien

  Wild-type and mLST8 deficient MEFs

• Konzentrationen

  Dissolved in DMSO, final concentration ~3 μM

• Inkubationszeit

  24, 48, and 72 hours

• Methode

  Cells are treated with KU-0063794 for 24, 48, and 72 hours, and the medium is changed every 24 hours with freshly dissolved this compound. For the measurement of cell growth, cells are washed once with PBS, and fixed in 4% (v/v) paraformaldehyde in PBS for 15 minutes. After washing once with water, the cells are stained with 0.1% Crystal Violet in 10% ethanol for 20 minutes and washed three times with water. Crystal Violet is extracted from cells with 0.5 mL of 10% (v/v) ethanoic (acetic) acid for 20 minutes. The eluate is then diluted 1:10 in water and absorbance at 590 nm is quantified. For the assessment of cell cycle distribution, cells are harvested by trypsinization, washed once in PBS, and re-suspended in ice-cold aq. 70% (v/v) ethanol. Cells are washed twice in PBS plus 1% (w/v) BSA and stained for 20 minutes in PBS plus 0.1% (v/v) Triton X-100 containing 50 g/mL propidium iodide and 50 g/mL RNase A. The DNA content of cells is determined using a FACSCalibur flow cytometer and CellQuest software. Red fluorescence (585 nm) is acquired on a linear scale, and pulse width analysis is used to exclude doublets. Cell-cycle distribution is determined using FlowJo software.

• Tiermodelle

  Nu/Nu nude mice

• Dosierungen

  8 mg/kg

• Verabreichung

  i.p.