OSI-027

OSI-027 zeigt selektive und ATP-kompetitive Hemmaktivitäten gegen mTORC1 und mTORC2 mit einer IC50 von 22 nM bzw. 65 nM. Darüber hinaus hemmt diese Verbindung die mTOR-Signalübertragung von Phospho-4E-BP1 mit einer IC50 von 1 μM in zellbasierten Assays. [1] Es zeigt dosisabhängige antiproliferative Aktivitäten gegen mehrere akute Leukämie-Zelllinien myeloid/megakaryozytischer Herkunft, einschließlich U937-, KG-1-, KBM-3B-, ML-1-, HL-60- und MEG-01-Zellen. [2] Eine aktuelle Studie zeigt, dass die Hemmung von mTORC1/2 durch diese Chemikalie die Phosphorylierung von Akt (S473) und die Zellproliferation in Brustkrebszellen wirksam unterdrückt. [3]

Im GEO-Kolorektal-Xenograft hemmt OSI-027 (65 mg/kg) sowohl mTORC1- als auch mTORC2-Effektoren, einschließlich der 4E-BP1-, Akt- und S6-Phosphorylierung. Darüber hinaus hemmt die gemeinsame Hemmung von mTORC1 und mTORC2 durch diese Verbindung das Tumorwachstum stärker als die Hemmung von mTORC1 durch Rapamycin. [1]

• Biochemische Assays

  Die Hemmung von mTORC1 und mTORC2 wird unter Verwendung eines nativen Enzymkomplexes, der aus HeLa-Lysaten bei 1 mM ATP immunpräzipitiert wurde, bestimmt. Zur Herstellung von Ganzzelllysaten aus HeLa-Zellen wird ein 25 g Zellpellet in 60 ml eisgekühltem Puffer A [40 mM HEPES (pH 7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Natriumpyrophosphat, 10 mM Glycerophosphat, 50 mM NaF, 0,5 mM Orthovanadat und EDTA-freie Proteaseinhibitoren, die 0,3 % CHAPS enthalten] für 30 Minuten auf einem Magnetrührer in einem Kühlraum lysiert. Nach dem Klären der Lysate durch Zentrifugation bei 13.000 g für 10 Minuten werden Protein-G-beschichtete 384-Well-Platten mit 0,25 μg mTOR-Antikörper in 15 μl Puffer A für 1 Stunde bei 4 °C inkubiert. Zu jeder Vertiefung werden 40 μg HeLa-Zelllysat in 15 μl Puffer A gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert, um die mTOR-Komplexe zu immunpräzipitieren. Die Platten werden 3 Mal mit Puffer A und zweimal mit Immunpräzipitations-Waschpuffer [Puffer B: 50 mM HEPES (pH 7,5) und 150 mM NaCl] gewaschen. OSI-027 wird in einer Konzentration von 10 μM zu jeder Vertiefung gegeben, und DMSO wird zu den Kontrollvertiefungen gegeben. Die Reaktion wird durch Zugabe von 150 ng His-markiertem 4E-BP1 als Substrat in Gegenwart oder Abwesenheit von 100 μM ATP zu jeder Vertiefung in 25 μl frisch zubereitetem Kinasepuffer [Puffer C: 20 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 4 mM MnCl₂, 10 mM β-Mercaptoethanol und 200 μM Vanadat] gestartet und bei Raumtemperatur (RT) 30 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wird gestoppt, indem 25 μl des Reaktionsgemisches aus jeder Vertiefung in entsprechende Vertiefungen frischer Ni-Chelat-beschichteter Platten überführt und über Nacht bei 4 °C, gefolgt von 2 Stunden bei 37 °C, inkubiert werden. Um die Phosphorylierung von 4E-BP1 nachzuweisen, werden die Platten einmal mit TBST (Tris-gepufferte Salzlösung mit 0,1 % Tween-20) mit 5 % Magermilchpulver gewaschen. Zu jeder Vertiefung werden 25 μl 1:1.000 verdünnte Phospho-4E-BP1-Antikörper in TBST mit 5 % Magermilch gegeben und 1 Stunde bei RT inkubiert. Die Platten werden einmal mit TBST gewaschen, und dann werden 25 μl Anti-Kaninchen-HRP (1:10.000 verdünnt) in TBST mit 5 % Magermilch hinzugefügt. Die Platten werden 1 Stunde bei RT inkubiert und 5 Mal mit TBST gewaschen. Zum Nachweis von Phospho-4E-BP1 werden 25 μl Chemilumineszenzreagenzien A+B hinzugefügt und die Chemilumineszenz mit einem Analyst-Plattenlesegerät gemessen.

• Zelllinien

  U937, KG-1, KBM-3B, ML-1, HL-60, and MEG-01

• Konzentrationen

  0-10 μM

• Inkubationszeit

  72 hours

• Methode

  Inhibition of proliferation is measured using the Cell Titer Glo Assay , as noted in figure legends. To generate dose–response curves, cell lines are seeded at a density of 5,000 cells per well in a 96-well plate. After 24 hours of plating, cells are dosed with varying concentrations of either OSI-027 or this compound. The signal for Cell Titer Glo Assay is determined 72 hours after dosing and normalized to that of vehicle-treated controls. Inhibition of proliferation, relative to vehicle-treated controls, is expressed as a fraction of 1 and graphed using PRISM software.

• Tiermodelle

  GEO colorectal cells are injected s.c. into the right flank of nu/nu CD-1 mice.

• Dosierungen

  ≤65 mg/kg

• Verabreichung

  Administered via gavage.