PF-02341066 (Crizotinib)

PF-2341066 zeigt eine ähnliche Potenz gegen die c-Met-Phosphorylierung in mIMCD3-Maus- oder MDCK-Hund-Epithelzellen mit einer IC50 von 5 nM bzw. 20 nM. Diese Verbindung zeigt eine verbesserte oder ähnliche Aktivität gegen NIH3T3-Zellen, die zur Expression von c-Met-ATP-Bindungsstellenmutanten V1092I oder H1094R oder der P-Loop-Mutante M1250T konstruiert wurden, mit einer IC50 von 19 nM, 2 nM und 15 nM, im Vergleich zu NIH3T3-Zellen, die den Wildtyp-Rezeptor exprimieren, mit einer IC50 von 13 nM. Im Gegensatz dazu wird eine deutliche Verschiebung der Potenz dieser Verbindung gegen Zellen beobachtet, die zur Expression der c-Met-Aktivierungsloop-Mutanten Y1230C und Y1235D konstruiert wurden, mit einer IC50 von 127 nM bzw. 92 nM, im Vergleich zum Wildtyp-Rezeptor. Es verhindert auch potent die Phosphorylierung von c-Met in NCI-H69- und HOP92-Zellen mit einer IC50 von 13 nM bzw. 16 nM, die die endogenen c-Met-Varianten R988C bzw. T1010I exprimieren. Diese Verbindung ist >1.000-fach selektiv für die VEGFR2- und PDGFRβ RTKs, >250-fach selektiv für IRK und Lck und ~40- bis 60-fach selektiv für Tie2, TrkA und TrkB, alles im Vergleich zu c-Met. Es ist 20- bis 30-fach selektiv für RON- und Axl-RTKs. Im Gegensatz dazu zeigt diese Verbindung eine nahezu äquivalente IC50 von 24 nM gegen die Nukleophosmin (NPM)-anaplastische Lymphomkinase (ALK)-onkogene Fusionsvariante des ALK RTK, die von der KARPAS299 humanen anaplastischen großzelligen Lymphom (ALCL)-Zelllinie exprimiert wird. Es hemmt c-Met-abhängige neoplastische Phänotypen von Krebszellen und angiogene Phänotypen von Endothelzellen. Diese Chemikalie unterdrückt das Wachstum menschlicher GTL-16-Magenkarzinomzellen mit einer IC50 von 9,7 nM. Es induziert Apoptose in GTL-16-Zellen mit einer IC50 von 8,4 nM. Es hemmt die HGF-stimulierte Migration und Invasion menschlicher NCI-H441-Lungenkarzinomzellen mit einer IC50 von 11 nM bzw. 6,1 nM. Es hemmt die MDCK-Zellstreuung mit einer IC50 von 16 nM. Es verhindert die HGF-stimulierte c-Met-Phosphorylierung, das Zellüberleben und die Matrigel-Invasion mit einer IC50 von 11 nM, 14 nM bzw. 35 nM. Darüber hinaus verhindert es die serumstimulierte HMVEC-Verzweigungstubulogenese (Bildung von Gefäßröhren) in Fibrin-Gelen. [1] Es hemmt auch potent die NPM-ALK-Phosphorylierung in Karpas299- oder SU-DHL-1-ALCL-Zellen mit einer IC50 von 24 nM. Diese Verbindung verhindert potent die Zellproliferation, die mit einem G(1)-S-Phasen-Zellzyklusarrest und der Induktion von Apoptose in ALK-positiven ALCL-Zellen mit einer IC50 von 30 nM verbunden ist, nicht aber in ALK-negativen Lymphomzellen. [2] Außerdem verhindert es das Osteosarkomverhalten, das mit dem primären Tumorwachstum (d.h. Proliferation und Überleben) sowie der Metastasierung (z.B. Invasion und Klonogenität) verbunden ist. [3]

Im GTL-16-Modell zeigt PF-2341066 die Fähigkeit, eine deutliche Regression großer etablierter Tumoren (>600 mm³) sowohl in den Behandlungskohorten mit 50 mg/kg/Tag als auch mit 75 mg/kg/Tag zu bewirken, mit einer 60%igen Abnahme des mittleren Tumorvolumens über den 43-tägigen Verabreichungsplan. In einer weiteren Studie zeigt diese Verbindung die Fähigkeit, das GTL-16-Tumorwachstum für >3 Monate vollständig zu hemmen, wobei nur 1 von 12 Mäusen eine signifikante Zunahme des Tumorwachstums über den 3-monatigen Behandlungsplan bei 50 mg/kg/Tag aufweist. Im NCI-H441 NSCLC-Modell wird eine 43%ige Abnahme des mittleren Tumorvolumens bei 50 mg/kg/Tag während des 38-tägigen PF-2341066-Verabreichungszyklus beobachtet. Im Caki-1 RCC-Modell wird eine 53%ige Abnahme des mittleren Tumorvolumens beobachtet, die mit einer Abnahme des Volumens jedes Tumors um mindestens 30% bei 50 mg/kg/Tag während des 33-tägigen PF-2341066-Verabreichungszyklus verbunden ist. Diese Verbindung zeigt auch eine nahezu vollständige Verhinderung des Wachstums etablierter Tumoren bei 50 mg/kg/Tag in den U87MG-Glioblastom- oder PC-3-Prostatakarzinom-Xenograftmodellen, mit 97% bzw. 84%iger Hemmung am letzten Studientag. Im Gegensatz dazu hemmt diese Chemikalie, p.o. mit 50 mg/kg/Tag verabreicht, das Tumorwachstum im MDA-MB-231-Mammakarzinommodell oder im DLD-1-Kolonkarzinommodell nicht signifikant. Eine signifikante dosisabhängige Reduktion von CD31-positiven Endothelzellen wird bei 12,5 mg/kg/Tag, 25 mg/kg/Tag und 50 mg/kg/Tag in GTL-16-Tumoren beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Hemmung von MVD eine dosisabhängige Korrelation zur Antitumorwirksamkeit aufweist. Diese Verbindung zeigt eine signifikante dosisabhängige Reduktion der humanen VEGFA- und IL-8-Plasmaspiegel in den GTL-16- und U87MG-Modellen. Eine deutliche Hemmung der phosphorylierten c-Met-, Akt-, Erk-, PLCü1- und STAT5-Spiegel wird in GTL-16-Tumoren nach p.o. Verabreichung dieser Verbindung beobachtet.[1] Die p.o. Verabreichung dieser Chemikalie an SCID-Beige-Mäuse mit Karpas299 ALCL-Tumorxenografts führt zu einer dosisabhängigen Antitumorwirksamkeit mit vollständiger Regression aller Tumoren bei einer Dosis von 100 mg/kg/Tag innerhalb von 15 Tagen nach der ersten Verabreichung der Verbindung. Zusätzlich wird die Hemmung wichtiger NPM-ALK-Signalmediatoren, einschließlich Phospholipase C-gamma, Signaltransduktoren und Aktivatoren der Transkription 3, extrazellulärer Signal-regulierter Kinasen und Akt durch diese Verbindung bei Konzentrationen oder Dosisstufen beobachtet, die mit der Hemmung der NPM-ALK-Phosphorylierung und -Funktion korrelierten.[2] Diese Verbindung verhindert das Osteosarkomverhalten, das mit dem primären Tumorwachstum (z.B. Proliferation und Überleben) sowie der Metastasierung (z.B. Invasion und Klonogenität) verbunden ist. Bei Nacktmäusen, die mit dieser Chemikalie über orale Magensonde behandelt wurden, werden das Wachstum und die damit verbundene Osteolyse und die extrakortikale Knochenmatrixbildung von Osteosarkom-Xenografts durch diese Verbindung verhindert.[3] Die Behandlung von c-MET-amplifizierten GTL-16-Xenografts mit 50 mg/kg dieser Verbindung führt zu einer Tumorregression, die mit einer langsamen Reduktion der ¹⁸F-FDG-Aufnahme und einer verminderten Expression des Glukosetransporters 1, GLUT-1, verbunden ist.[4]

• Zelluläre Kinase-Phosphorylierungs-ELISA-Assays

  Zellen werden in 96-Well-Platten in Medien ausgesät, die mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt sind, und nach 24 h in serumfreie Medien [mit 0,04% Rinderserumalbumin (BSA)] überführt. In Experimenten zur Untersuchung der Liganden-abhängigen RTK-Phosphorylierung werden entsprechende Wachstumsfaktoren für bis zu 20 Minuten hinzugefügt. Nach Inkubation der Zellen mit dieser Verbindung für 1 h und/oder geeigneten Liganden für die angegebenen Zeiten werden die Zellen einmal mit HBSS, ergänzt mit 1 mM Na₃VO₄, gewaschen, und Proteinextrakte werden aus den Zellen gewonnen. Anschließend wird die Phosphorylierung ausgewählter Proteinkinasen mittels einer Sandwich-ELISA-Methode unter Verwendung spezifischer Fangantikörper, die zum Beschichten von 96-Well-Platten verwendet werden, und eines Nachweisantikörpers, der spezifisch für phosphorylierte Tyrosinreste ist, bestimmt. Antikörperbeschichtete Platten werden (a) über Nacht bei 4 °C in Gegenwart von Proteinextrakten inkubiert; (b) siebenmal in 1% Tween 20 in PBS gewaschen; (c) für 30 Minuten in einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Anti-Gesamt-Phosphotyrosin (PY-20)-Antikörper (1:500) inkubiert; (d) erneut siebenmal gewaschen; (e) in 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidinperoxidase-Substrat inkubiert, um eine kolorimetrische Reaktion einzuleiten, die durch Zugabe von 0,09 N H₂SO₄ gestoppt wird; und (f) die Absorption bei 450 nm mit einem Spektrophotometer gemessen.

• Zelllinien

  GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells

• Konzentrationen

  0-256 nM

• Inkubationszeit

  1 hour

• Methode

  Cells including GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells are seeded in 96-well plates in media supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and transferred to serum-free media [with 0.04% bovine serum albumin (BSA)] after 24 hours. In experiments investigating ligand-dependent RTK phosphorylation, corresponding growth factors are added for up to 20 minutes. After incubation of cells with this compound for 1 hour and/or appropriate ligands for the designated times, cells are washed once with HBSS supplemented with 1 mM Na₃VO₄, and protein lysates are generated from cells. Subsequently, phosphorylation of selected protein kinases is assessed by a sandwich ELISA method using specific capture antibodies used to coat 96-well plates and a detection antibody specific for phosphorylated tyrosine residues. Antibody-coated plates are (a) incubated in the presence of protein lysates at 4 °C overnight; (b) washed seven times in 1% Tween 20 in PBS; (c) incubated in a horseradish peroxidase–conjugated anti–total-phosphotyrosine (PY-20) antibody (1:500) for 30 min; (d) washed seven times again; (e) incubated in 3,3^′,5,5^′-tetramethyl benzidine peroxidase substrate to initiate a colorimetric reaction that is stopped by adding 0.09 N H₂SO₄; and (f) measured for absorbance in 450 nm using a spectrophotometer.

• Tiermodelle

  Female or male nu/nu mice bearing NCI-H441,or DLD-1, or MDA-MB-231

• Dosierungen

  12.5 mg/kg/day, 25 mg/kg/day, and 50 mg/kg/day

• Verabreichung

  Administered via p.o.