PP121

PP121 interagiert selektiv in einer hydrophoben Tasche, die sowohl bei Tyrosinkinasen als auch bei PI3Ks konserviert ist, nicht bei Serin-Threonin-Kinasen. PP121 bildet eine Wasserstoffbrücke zu Glu310 in Src, wodurch die strukturelle Rolle des katalytischen Lysins effektiv ersetzt wird und eine Anordnung der Helix C sowie eine Stabilisierung einer aktiven Konformation resultieren. PP121 hemmt auch andere PI3Ks, einschließlich p110α und DNA-PK, mit IC50-Werten von 52 nM bzw. 60 nM. PP121 blockiert potent und dosisabhängig die Phosphorylierung von Akt, p70S6K und S6 in zwei Glioblastom-Zelllinien, U87 und LN229. PP121 hemmt potent die Proliferation einer Untergruppe von Tumorzelllinien durch direkte Hemmung von PI3Ks und mTOR. PP121 induziert einen G0/G1-Arrest in LN220-, U87- und Seg1-Zellen. PP121 blockiert auch die durch v-Src induzierte Tyrosin-Phosphorylierung in NIH3T3-Zellen, die mit v-Src(Thr338) transformiert sind. PP121 konnte die Aktin-Stressfaserfärbung in NIH3T3-Zellen, die mit v-Src(Thr338) transformiert waren, wiederherstellen. PP121 hemmt bei einer geringen Konzentration von 40 nM die Ret-Autophosphorylierung in TT-Schilddrüsenkarzinomzellen, die die onkogene Ret-Mutante C634W35 exprimieren. PP121 hemmt die Zellproliferation mit einem IC50-Wert von 50 nM in TT-Schilddrüsenkarzinomzellen. PP121 hemmt die Zellproliferation, die nur mit VEGF stimuliert wurde, mit einem IC50-Wert von 41 nM in humanen umbilicalen Venenendothelzellen (HUVECs). PP121 hemmt direkt die durch Bcr-Abl induzierte Tyrosin-Phosphorylierung, was zu einer medikamenteninduzierten Apoptose in K562-Zellen und einer Kombination aus Apoptose und Zellzyklusarrest in Bcr-Abl-exprimierenden BaF3-Zellen führt. [1]

• Kinase-Assays

  Gereinigte Kinasedomänen werden mit PP121 in 2- oder 4-facher Verdünnung über einen Konzentrationsbereich von 1 nM–50 µM oder mit Vehikel (0,1 % DMSO) in Anwesenheit von 10 µM ATP, 2,5 µCi γ-³²P-ATP und Substrat inkubiert. Die Reaktionen werden durch Auftragen auf Nitrocellulose- oder Phosphocellulosemembranen, je nach Substrat, beendet; diese Membran wird dann 5–6 Mal gewaschen, um ungebundene Radioaktivität zu entfernen, und getrocknet. Die übertragene Radioaktivität wird mittels Phosphorimaging quantifiziert und die IC50-Werte werden durch Anpassen der Daten an eine sigmoide Dosis-Wirkungs-Kurve unter Verwendung der Prism-Software berechnet.

• Zelllinien

  U87, LN229, NIH3T3, HUVECs, BaF3 and TT thyroid carcinoma cells

• Konzentrationen

  0.04-20 μM

• Inkubationszeit

  24-72 hours

• Methode

  For western blot analysis, cells are grown in 12-well plates and treated with PP-121 at the indicated concentrations or vehicle (0.1% DMSO). Treated cells are lysed, lysates are resolved by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose and blotted. For cell proliferation assays,cells are grown in 96-well plates are treated with PP-121 at 4-fold dilutions (10 µM - 0.040 μM) or vehicle (0.1% DMSO). After 72 hours cells are exposed to Resazurin sodium salt (22 µM) and fluorescence is quantified. IC50 values are calculated using Prism software. For proliferation assays involving single cell counting, non-adherent cells are plated at low density (3–5% confluence) and treated with PP-121 (2.5 µM) or vehicle (0.1% DMSO). Cells are diluted into trypan blue daily and viable cells counted using a hemocytometer. For apoptosis and cell cycle analysis, cells are treated with the indicated concentration of PP-121 or vehicle (0.1% DMSO) for 24–72 hours. Cells are either stained live with AnnexinV-FITC or fixed with ethanol and stained with propidium iodide. Cell populations are separated using a FacsCalibur flow cytometer; data is collected using CellQuest Pro software and analyzed with either ModFit or FlowJo Software.