Pemetrexed Disodium (LY231514)

Die TS-Aktivität wird mittels einer spektrophotometrischen Methode bestimmt, bei der die Zunahme der Absorption bei 340 nm überwacht wird, die durch die Bildung des Produkts 7,8-Dihydrofolat entsteht. Der Assaypuffer enthält 50 mM N-Tris[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethansulfonsäure, 25 mM MgC1₂, 6,5 mM Formaldehyd, 1 mM EDTA und 75 mM 2-Mercaptoethanol, pH 7,4. Die Konzentrationen von Deoxyuridylatmonophosphat, 6R-MTHF und hIS betragen 100 μM, 30 μM bzw. 30 nM (1,7 Milliunits/mL). Bei der 6R-MTHF-Konzentration werden eine ungehemmte Reaktion und sechs Inhibitorkonzentrationen getestet. K_{i app}-Werte werden durch Anpassung der Daten an die Morrison-Gleichung mittels nichtlinearer Regressionsanalyse mit Hilfe des Programms ENZFITTER bestimmt. K_i-Werte werden mit der Gleichung berechnet: K_{i app} = K_i(1 + [S]/K_m), wobei [S] gleich 30 μM und K_m gleich 3 μM ist. Die DHFR-Aktivität wird spektrophotometrisch durch Überwachung des Verschwindens der Substrate NADPH und 7,8-Dihydrofolat bei 340 nm bestimmt. Die Reaktion findet bei 25 °C in 0,5 mL 50 mM Kaliumphosphatpuffer statt, der 150 mM KCl und 10 nM 2-Mercaptoethanol, pH 7,5, und 14 nM (0,34 Milliunit/mL) DHFR enthält. Die NADPH-Konzentration beträgt 10 μM und 7,8-Dihydrofolat wird bei 5, 10 oder 15 μM variiert. Bei jeder 7,8-Dihydrofolat-Konzentration werden eine ungehemmte Reaktion und sieben Inhibitorkonzentrationen getestet. Das Mikrocomputerprogramm ENZFITI'ER wird verwendet, um K_{i app}-Werte durch Anpassung der Daten an die Morrison-Gleichung mittels nichtlinearer Regressionsanalyse zu erhalten. K_{i app} = K_i(1 + [S]/K_m), wobei [S] gleich der verwendeten Konzentration von 7,8-Dihydrofolat ist und K_m von 7,8-Dihydrofolat gleich 0,15 μM ist. Die GARFT-Aktivität wird spektrophotometrisch durch Überwachung der Zunahme der Absorption bestimmt, die durch die Bildung des Produkts 5,8-Dideazafolat bei 295 nm entsteht. Das Reaktionslösungsmittel enthält 75 mM HEPES, 20 % Glycerin und 50 mM α-Thioglycerol, pH 7,5, bei 25 °C. Die Konzentrationen der verwendeten Substrate und Enzyme betragen 10 μM α,β-Glycinamid-Ribonucleotid, 0–10 μM 10-Formyl-5,8-dideazafolsäure und 10 nM (1,9 Milliunits/mL) GARFT. K_i-Werte werden mit dem Enzymmechanismusprogramm des Beckman DU640 Spektrophotometers berechnet, das die nichtlineare Regressionsanalyse verwendet, um Daten an die Michaelis-Menten-Gleichung für kompetitive Hemmung anzupassen.

CCRF-CEM leukemia, GC3/C1 colon carcinoma, and HCT-8 ileocecal carcinoma cells.

0-30 μM

72 hours

Dose-response curves are generated to determine the concentration required for 50% inhibition of growth (IC50). Pemetrexed disodium is dissolved initially in DMSO at a concentration of 4 mg/mL and further diluted with cell culture medium to the desired concentration. CCRF-CEM leukemia cells in complete medium are added to 24-well Cluster plates in a total volume of 2.0 mL. This compound at various concentrations are added to duplicate wells so that the final volume of DMSO is 0.5%. The plates are incubated for 72 hour at 37 °C in an atmosphere of 5% CO₂ in air. At the end of the incubation, cell numbers are determined on a ZBI Coulter counter. For several studies, IC50s are determined for each compound in the presence of either 300 μM AICA, 5 μM thymidine, 100 μM hypoxanthine, or combination of 5 μM hymidine plus 100 μM hypoxanthine. For adherent tumor cells, a modification of the original MTT colorimetric assay is used to measure cell cytotoxicity. The human tumor cells are seeded in 100 μL assay medium/well in 96-well flat-bottomed tissue culture plates. The assay medium contains folic acid-free RPMI 1640 supplemented with 10% FCS and either 2 nM folinic acid or 2.3 μM folic acid as the sole folate source. Well 1A is left blank. Stock solutions of antifolates are prepared in Dulbecco's PBS at 1 mg/mL, and a series of 2-fold dilutions are subsequently made in PBS. Ten-μL aliquots of each concentration are added to triplicate wells. Plates are incubated for 72 hours at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO₂-in-air. MTT is dissolved in PBS at 5 mg/mL, 10 μL of stock MTF solution are added to each well of an assay, and the plates are incubated at 37 °C for 2 additional hours. Following incubation, 100 μL of DMSO are added to each well. After thorough formazan solubilization, the plates are read on a Dynatech MR600 reader, using a test wavelength of 570 nm and a reference wavelength of 630 nm. The IC50 is determined as the concentration of drug required to inhibit cell growth by 50% compared to an untreated controls.

EMT-6 mammary carcinoma, the human HCT 116 colon carcinoma, and the human H460 non-small cell lung carcinoma are injected s.c. into the nude mice.

100 mg/kg or 150 mg/kg

Administered via i.p.