Sorafenib Tosylate (BAY 43-9006)

Sorafenib tosylate hemmt sowohl die Wildtyp- als auch die V599E-Mutante-B-Raf-Aktivität mit einer IC50 von 22 nM bzw. 38 nM. Diese Verbindung hemmt auch mVEGFR2 (Flk-1), mVEGFR3, mPDGFRβ, FLT3 und c-Kit mit einer IC50 von 15 nM, 20 nM, 57 nM, 58 nM bzw. 68 nM. Sie hemmt FGFR-1 schwach mit einem IC50-Wert von 580 nM. Diese Chemikalie ist nicht aktiv gegen ERK-1, MEK-1, EGRF, HER-2, IGFR-1, c-Met, PKB, PKA, cdk1/CyclinB, PKCα, PKCγ und pim-1. Es hemmt deutlich die VEGFR2-Phosphorylierung in NIH 3T3-Zellen mit einer IC50 von 30 nM und die FLT-3-Phosphorylierung in HEK-293-Zellen mit einer IC50 von 20 nM. Es blockiert wirksam die MEK 1/2- und ERK 1/2-Phosphorylierung in den meisten Zelllinien, jedoch nicht in A549- oder H460-Zellen, während es keine Wirkung auf die Hemmung des PKB-Signalwegs hat. Es hemmt die Proliferation von HAoSMC- und MDA-MB-231-Zellen mit einer IC50 von 0,28 μM bzw. 2,6 μM.[1] Zusätzlich zur Hemmung des Raf/MEK/ERK-Signalwegs hemmt es signifikant die Phosphorylierung von eIF4E und reguliert die Mcl-1-Spiegel in Hepatozellulären Karzinomzellen (HCC) auf MEK/ERK-unabhängige Weise herunter. Es hemmt die Proliferation von PLC/PRF/5- und HepG2-Zellen mit einer IC50 von 6,3 μM bzw. 4,5 μM und führt zu einer signifikanten Induktion der Apoptosis. [2]

Die orale Verabreichung von Sorafenib tosylate (~60 mg/kg) zeigt eine breite, dosisabhängige Antitumoraktivität gegen eine Vielzahl von menschlichen Tumoren in Xenotransplantatmodellen, darunter MDA-MB-231, Colo-205, HT-29, DLD-1, NCI-H460 und A549, ohne Anzeichen von Toxizität. In Verbindung mit der Antitumorwirksamkeit hemmt diese Verbindung wirksam die MEK 1/2-Phosphorylierung und die pPERK 1/2-Spiegel in HT-29- und MDA-MB-231-Xenotransplantaten, jedoch nicht in Colo-205-Xenotransplantaten, und unterdrückt signifikant die Tumormikrogefäßfläche (MVA) und die Mikrogefäßdichte (MVD) in MDA MB-231-, HT-29 und Colo-205-Tumor-Xenotransplantaten.[1] Diese Kombinationsbehandlung bewirkt eine dosisabhängige Wachstumshemmung von PLC/PRF/5-Tumor-Xenotransplantaten in SCID-Mäusen mit TGIs von 49 % bzw. 78 % bei 10 mg/kg und 30 mg/kg, was mit der Hemmung der ERK- und eIF4E-Phosphorylierung, der Verringerung der Mikrogefäßfläche und der Induktion der Apoptosis von Tumorzellen übereinstimmt. [2]

• Biochemische Assays

  Rekombinante Baculoviren, die Raf-1 (Reste 305–648) und B-Raf (Reste 409–765) exprimieren, werden als Fusionsproteine gereinigt. Vollständiges humanes MEK-1 wird durch PCR erzeugt und als Fusionsprotein aus Escherichia coli-Lysaten gereinigt. Sorafenib-Tosylat wird zu einer Mischung aus Raf-1 (80 ng) oder B-Raf (80 ng) mit MEK-1 (1 μg) in Assay-Puffer [20 mM Tris (pH 8,2), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂ und 0,15 % β-Mercaptoethanol] in einer Endkonzentration von 1 % DMSO. Der Raf-Kinase-Assay (Endvolumen 50 μl) wird durch Zugabe von 25 μl 10 μM γ[³³P]ATP (400 Ci/mol) gestartet und 25 Minuten lang bei 32 °C inkubiert. Phosphoryliertes MEK-1 wird durch Filtration auf einer Phosphocellulosematte gesammelt, und 1 %ige Phosphorsäure wird verwendet, um ungebundene Radioaktivität wegzuwaschen. Nach dem Trocknen durch Mikrowellenerwärmung wird ein β-Plattenzähler verwendet, um die filtergebundene Radioaktivität zu quantifizieren. Die Kinasedomäne des humanen VEGFR2 (KDR) wird aus Sf9-Lysaten exprimiert und gereinigt. Zeitaufgelöste Fluoreszenzenergietransfer-Assays für VEGFR2 werden in 96-Well-Platten im Format des zeitaufgelösten Fluoreszenzenergietransfers durchgeführt. Die endgültigen Reaktionsbedingungen sind wie folgt: 1 bis 10 μM ATP, 25 nM Poly-GT-Biotin, 2 nM europiummarkierter Phospho-(p)-Tyr-Antikörper (PY20), 10 nM APC, 1 bis 7 nM zytoplasmatische Kinasedomäne in Endkonzentrationen von 1 % DMSO, 50 mM HEPES (pH 7,5), 10 mmol/L MgCl_₂, 0,1 mmol/L EDTA, 0,015 % Brij-35, 0,1 mg/ml BSA und 0,1 % β-Mercaptoethanol. Das Reaktionsvolumen beträgt 100 μl und die Reaktion wird durch Zugabe des Enzyms gestartet. Die Platten werden sowohl bei 615 als auch bei 665 nm auf einem Perkin-Elmer VictorV Multilabel-Zähler etwa 1,5 bis 2,0 Stunden nach Reaktionsbeginn ausgelesen. Das Signal wird als Verhältnis berechnet: (665 nm/615 nm) × 10.000 für jede Vertiefung. Zur Ermittlung des IC50-Werts wird diese Verbindung vor der Enzymaktivierung hinzugefügt. Eine 50-fache Stammlösung wird mit dieser Chemikalie hergestellt, die in einer 50 %igen DMSO/50 %igen destillierten Wasserlösung 1:3 seriell verdünnt wird. Die Endkonzentrationen dieser Verbindung liegen zwischen 10 μM und 4,56 nM in 1 % DMSO.

• Zelllinien

  MDA-MB-231, and HAoSMC

• Konzentrationen

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Inkubationszeit

  72 hours

• Methode

  Cells are exposed to increasing concentrations of Sorafenib tosylate for 72 hours. Cell number is quantitated using the Cell TiterGlo ATP Luminescent assay kit. This assay measures the number of viable cells per well by measurement of luminescent signal based on amount of cellular ATP.

• Tiermodelle

  Female NCr-nu/nu mice implanted s.c. with MDA-MB-231, Colo-205, HT-29, H460, or A549 cells

• Dosierungen

  ~60 mg/kg

• Verabreichung

  Orally once daily