Tandutinib (MLN518)

Tandutinib (MLN518) hat eine geringe Aktivität gegen EGFR, FGFR, KDR, InsR, Src, Abl, PKC, PKA und MAPKs. Es hemmt das IL-3-unabhängige Zellwachstum und die FLT3-ITD-Autophosphorylierung mit einer IC50 von 10-100 nM. Diese Verbindung hemmt auch die Proliferation menschlicher Leukämie-Ba/F3-Zellen, die FLT3-ITD-Mutationen enthalten, mit IC50-Werten von 10-30 nM, sowie der FLT3-ITD-positiven Molm-13- und Molm-14-Zellen mit einer IC50 von 10 nM. In FLT3-ITD-positiven Molm-14-Zellen, aber nicht in den FLT3-ITD-negativen THP-1-Zellen, führt die Behandlung mit Tandutinib zu einer signifikanten Apoptose von 51 % bzw. 78 % nach 24 bzw. 96 Stunden, bedingt durch eine spezifische FLT3-Inhibition. [1] Es hemmt bevorzugt das Wachstum von Blastenkolonien von FLT3-ITD-positiven im Vergleich zu ITD-negativen Patienten mit AML, ohne die Koloniebildung normaler menschlicher Vorläuferzellen zu beeinflussen. [2]

Die orale Verabreichung von Tandutinib (MLN518) mit 60 mg/kg bid erhöht das Überleben von Mäusen mit Ba/F3-Zellen, die den W51 FLT3-ITD-Mutanten exprimieren, signifikant und führt zu einer signifikanten Reduktion der Mortalität in einem Mausknochenmarktransplantationsmodell. [1] Die Behandlung mit dieser Verbindung bei 180 mg/kg zweimal täglich weist eine milde Toxizität gegenüber der normalen Hämatopoese auf, ist jedoch eine Dosis, bei der sie bei der Behandlung von FLT3-ITD-positiver Leukämie bei Mäusen wirksam ist. [2]

• Zellbasierte Rezeptor-Autophosphorylierungs-Assays

  Autophosphorylierungs-Assays von PDGFR-Familienkinasen sind zellbasierte enzymgebundene Immunosorbens-Assays (ELISA) unter Verwendung von CHO-Zellen, die Wildtyp-PDGFR , das chimäre Protein PDGFR /c-Kit und PDGFR /Flt3 exprimieren, die die extrazellulären und Transmembrandomänen von PDGFR und die zytoplasmatische Domäne von c-Kit und Flt-3 enthalten. Die Zellen werden bis zur Konfluenz in 96-Well-Mikrotiterplatten unter Standard-Gewebekulturbedingungen kultiviert, gefolgt von einer 16-stündigen Serumstarvation. Kurz gesagt, ruhende Zellen werden bei 37 °C mit steigenden Konzentrationen von Tandutinib (MLN518) für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 8 nM PDGF-BB für 10 Minuten. Die Zellen werden in 100 mM Tris, pH 7,5, 750 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 10 mM Natriumpyrophosphat, 50 mM NaF, 10 μg/mL Leupeptin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM Natriumvanadat lysiert, und das Lysat wird durch Zentrifugation bei 15.000 g für 5 Minuten geklärt. Geklärte Lysate werden in eine zweite Mikrotiterplatte überführt, deren Vertiefungen zuvor mit 500 ng/Well 1B5B11 Anti-PDGFR mAb beschichtet und dann 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Nach dreimaligem Waschen mit Bindepuffer (0,3% Gelatine, 25 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,01% Tween 20) werden 250 ng/mL eines polyklonalen Kaninchen-Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers zugegeben und die Platten 60 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend wird jede Vertiefung dreimal mit Bindepuffer gewaschen und mit 1 μg/mL eines Meerrettichperoxidase-konjugierten Anti-Kaninchen-Antikörpers 60 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Vertiefungen werden vor der Zugabe von 2,2

• Zelllinien

  Ba/F3, Molm-13, Molm-14, HL60, AML193, KG-1, KG-1a, THP-1, and RS4;11

• Konzentrationen

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~30 μM

• Inkubationszeit

  ~7 days

• Methode

  Cells are exposed to increasing concentrations of Tandutinib (MLN518) (0.004-30 μM). They are grown for 3-7 days in tissue culture, and viable cells, determined by Trypan blue dye exclusion, are counted. At daily intervals, cells are harvested, washed, and resuspended in 100 uL binding buffer containing 10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, and 2.5 mM CaCl₂. Annexin V-FITC (100 ng) and propidium iodide (250 ng) are added to the cell suspension followed by incubation at room temperature for 15 minutes. Flow cytometry is performed immediately after staining on a FACSort flow cytometer with excitation at 488 nm. Fluorescence of annexin V-FITC and DNA propidium iodide staining are measured at 515 nm and 585 nm, respectively.

• Tiermodelle

  Female athymic nude (nu/nu) mice injected with Ba/F3 cells expressing W51 FLT3-ITD mutant

• Dosierungen

  40-120 mg/kg/day

• Verabreichung

  Orally by gavage