VX-809 (Lumacaftor)

Lumacaftor (VX-809) wirkt auf der Ebene des ER, um einem Teil des F508del-CFTR eine korrekt gefaltete Form anzunehmen, das ER zu verlassen und zur Zelloberfläche zu mobilisieren, um normal zu funktionieren. In Fischer-Ratten-Schilddrüsenzellen (FRT), die F508del-CFTR exprimieren, verbessert diese Verbindung die F508del-CFTR-Reifung signifikant um das 7,1-fache mit einer EC50 von 0,1 μM und verstärkt den F508del-CFTR-vermittelten Chloridtransport um etwa das 5-fache mit einer EC50 von 0,5 μM, während VRT-768 höhere EC50-Werte von 7,9 μM bzw. 16 μM aufweist. In HEK-293-Zellen, die F508del-CFTR exprimieren, erhöht es (3 μM) den Austritt von F508del-CFTR aus dem ER um das 6-fache und erreicht Niveaus, die 34 % des CFTR entsprechen. In primären menschlichen bronchialen Epithelzellen (HBE) mit F508del-CFTR-Mutation erhöht der Wirkstoff die CFTR-Reifung und verstärkt die Chloridsekretion mit einer EC50 von 350 nM bzw. 81 nM, was wirksamer ist als Corr-4a und VRT-325. F508del-CFTR, korrigiert durch den Wirkstoff, weist eine Einzelkanal-Öffnungswahrscheinlichkeit von 0,39 auf, ähnlich dem normalen CFTR von 0,40. Im Gegensatz zu VX-770 ist es kein CFTR-Potentiator, da eine akute Zugabe keine Auswirkung auf die F508del-CFTR-Funktion hat. Im Gegensatz zu VRT-325 und Corr-4a verbessert es die Verarbeitung der normalen oder mutierten Formen von hERG oder P-gp sowie anderer krankheitsverursachender fehlplatzierter Proteine, einschließlich α1-Antitrypsin-Z-Mutante (E342K-α1-AT) oder N370S-β-Glucosidase, nicht, was darauf hindeutet, dass es spezifisch für CFTR ist. Es hat in Kombination mit VRT-325 oder Corr-4a eine additive Wirkung auf den CFTR-vermittelten Chloridtransport in kultivierten F508del-HBE. [1]

Lumacaftor (VX-809; VRT 826809) ist ein CFTR-Modulator, der die Faltung und den Transport des CFTR-Proteins korrigiert.

• F508del-CFTR-Reifung

  FRT-Zellen, die F508del-CFTR stabil exprimieren, werden 48 Stunden lang mit steigenden Konzentrationen von Lumacaftor (VX-809) behandelt. Nach der Inkubation werden die Zellen in eiskalter D-PBS-Lösung (ohne Kalzium und Magnesium) geerntet und bei 1.000 × g bei 4 °C pelletiert. Die Zellpellets werden in 1 % Nonidet P-40, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 200 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,8 und 1 mM EDTA plus Proteaseinhibitor-Gemisch (1:250) 30 Minuten lang auf Eis lysiert. Die Lysate werden 10 Minuten lang bei 10.000 × g bei 4 °C zentrifugiert, um Zellkerne und unlösliches Material zu pelletieren. Etwa 12 μg Gesamtprotein werden in Laemmli-Puffer mit 5 % β-Mercaptoethanol bei 37 °C 5 Minuten lang erhitzt und auf ein 3 % bis 8 % Tris-Acetat-Gel geladen. Das Gel wird auf Nitrozellulose übertragen und für das Western Blotting unter Verwendung eines monoklonalen CFTR-Antikörpers oder eines polyklonalen Antikörpers gegen GAPDH verarbeitet. Die Blots werden durch verstärkte Chemilumineszenz entwickelt. Die Quantifizierung der relativen Mengen der Banden C und GAPDH wird unter Verwendung der NIH ImageJ-Analyse gescannter Filme durchgeführt.

• Zelllinien

  FRT (CFTR or F508del-CFTR), HEK-293 (CFTT or F508del-CFTR) , and HBE cells

• Konzentrationen

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~0.1 mM

• Inkubationszeit

  24 or 48 hours

• Methode

  Cells are exposed to various concentrations of Lumacaftor (VX-809) for 24 or 48 hours. Ussing chamber techniques are used to record the transepithelial current (I_T) resulting from CFTR-mediated chloride transport. The single-channel activity of CFTR is measured by using excised inside-out membrane patch recordings. Immunoblot techniques using the monoclonal CFTR antibody are used to measure CFTR maturation in FRT, HEK-293, or HBE cells expressing CFTR or F508del-CFTR.

• Tiermodelle

  Male Sprague– Dawley rats

• Dosierungen

  1 mg/kg

• Verabreichung

  p.o.