Foretinib

Die Kinase-Inhibition wird unter Verwendung eines von drei Assay-Formaten untersucht: [³³P]Phosphoryltransfer, Luciferase-gekoppelte Chemilumineszenz oder AlphaScreen-Tyrosinkinase-Technologie. IC50-Werte werden durch nichtlineare Regressionsanalyse unter Verwendung von XLFit berechnet.³³P-Phosphoryltransfer-Kinase-Assay-Reaktionen werden in 384-Well-Mikrotiterplatten mit weißem, klarem Boden und hoher Bindung (Greiner, Monroe, NC) durchgeführt. Die Platten werden mit 2 μg/Well Protein oder Peptidsubstrat in einem Volumen von 50 μL Beschichtungspuffer beschichtet, der 40 μg/mL Substrat (Poly(Glu, Tyr) 4:1, 22,5 mM Na2CO₃, 27,5 mM NaHCO₃, 50 mM NaCl und 3 mM NaN₃) enthielt. Beschichtete Platten werden nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur (RT) einmal mit 50 μL Assay-Puffer gewaschen. Testsubstanzen und Enzyme werden mit ³³P-γ-ATP (3,3 μCi/nmol) in einem Gesamtvolumen von 20 μL kombiniert. Die Reaktionsmischung wird 2 Stunden bei RT inkubiert und durch Aspiration beendet. Die Mikrotiterplatten werden anschließend 6 Mal mit 0,05% Tween-PBS-Puffer (PBST) gewaschen. Szintillationsflüssigkeit (50 μL/Well) wird hinzugefügt und das inkorporierte ³³P wird mittels Flüssigkeitsszintillationsspektrometrie unter Verwendung eines MicroBeta-Szintillationszählers gemessen.Luciferase-gekoppelte Chemilumineszenz-Assay-Reaktionen werden in 384-Well-Mikrotiterplatten mit weißer, mittlerer Bindung (Greiner) durchgeführt. In einem ersten Schritt werden Enzym und Verbindung kombiniert und 60 Minuten inkubiert; die Reaktionen werden durch Zugabe von ATP und Peptidsubstrat (Poly(Glu, Tyr) 4:1) in einem Endvolumen von 20 μL initiiert und 2-4 Stunden bei RT inkubiert. Nach der Kinase-Reaktion wird ein 20 μL Aliquot von Kinase Glo (Promega, Madison, WI) hinzugefügt und das Lumineszenzsignal wird mit einem Victor-Plattenleser gemessen. Der gesamte ATP-Verbrauch ist auf 50% begrenzt. AlphaScreenTM Tyrosinkinase-Assay-Donor-Beads, die mit Streptavidin beschichtet sind, und Akzeptor-Beads, die mit PY100 Anti-Phosphotyrosin-Antikörper beschichtet sind, werden verwendet. Biotinyliertes Poly(Glu,Tyr) 4:1 wird als Substrat verwendet. Die Substratphosphorylierung wird durch Zugabe von Donor-/Akzeptor-Beads durch Lumineszenz nach der Bildung des Donor-Akzeptor-Bead-Komplexes gemessen. Kinase und Testsubstanzen werden kombiniert und 60 Minuten vorinkubiert, gefolgt von der Zugabe von ATP und biotinyliertem Poly(Glu, Tyr) in einem Gesamtvolumen von 20 μL in 384-Well-Mikrotiterplatten mit weißer, mittlerer Bindung (Greiner). Die Reaktionsmischungen werden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionen werden durch Zugabe von 10 μL einer 15-30 μg/mL AlphaScreen-Bead-Suspension, enthaltend 75 mM Hepes, pH 7,4, 300 mM NaCl, 120 mM EDTA, 0,3% BSA und 0,03% Tween-20, abgebrochen. Nach 2-16 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur werden die Platten mit einem AlphaQuest-Lesegerät ausgelesen.

B16F10, A549, and HT29 cells

40 nM

12 to 14 days

B16F10, A549, and HT29 cells (1.2× 10³ per well) are mixed with soft agar and seeded in a 96-well plate containing 10% FBS and EXEL-2880 over a base agar layer. For normoxic conditions, the plates are incubated (37°C) for 12 to 14 days in 21% oxygen, 5% CO₂, and 74% nitrogen, whereas incubation (37 °C) under hypoxic conditions is done in a hypoxia chamber in 1% oxygen, 5% CO₂, and 94% nitrogen. The number of colonies is evaluated under each condition following addition of 50% Alamar Blue and fluorescence detection.

B16F10 tumor cells (2 × 10 ⁵) are implanted via i.v. tail vein injection into athymic nude mice (NCr or BALB/c) 5 to 8 weeks old

100 mg/kg

Administered via oral gavage