ZM 447439

In vitro hemmt ZM-447439 selektiv rekombinante humane Aurora A und B mit IC50-Werten von 110 bzw. 130 nM, während andere Proteinkinasen verschiedener Strukturtypen, einschließlich der mitotischen Kinasen CDK1 und PLK1, mit IC50-Werten >10 μM gehemmt werden. [1] Der Aurora Kinase Inhibitor, ZM-447439, hemmt das Wachstum aller drei Zelllinien zeit- und dosisabhängig mit IC50-Werten von 3 μM (BON), 0,9 μM (QGP-1) und 3 μM (MIP-101) nach 72 Stunden kontinuierlicher Exposition. Zusätzlich induziert ZM-447439 stark die Zellapoptose, indem es die DNA-Fragmentierung und die Aktivierung von Caspase 3 und 7 fördert, und arretiert GEP-NET-Zellen in der G₀ /G₁- und G₂/M-Phase des Cell Cycle. [2] Im Mausembryo führt die Hemmung der Aurora Kinase-Aktivität durch ZM-447439 zu Anomalien während der Mitose durch Regulierung der Phosphorylierung von Histon H3 Serin 10 (H3S10Ph) von der G2- zur Metaphase mit unterschiedlichen Störungen in jedem embryonalen Zyklus. [3] Eine aktuelle Studie zeigt, dass ZM-447439 eine wachstumshemmende und proapoptotische Wirkung auf Gebärmutterhalskrebs-SiHa-Zellen aufweist und die Chemosensitivität erhöht. [4]

• In vitro Kinase-Assays

  Rekombinante Aurora A und B werden als NH₂-terminale His₆-getaggte Fusionsproteine unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems exprimiert. Aurora A wird mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ni-NTA-Agarose gereinigt, und Aurora B wird mittels Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von CM Sepharose Fast Flow gereinigt. 1 ng gereinigtes rekombinantes Enzym wird zu einem Reaktionscocktail gegeben, der 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM KCl, 2,5 mM NaF, 0,6 mM DTT, 6,25 mM MnCl₂, 10 μM Peptidsubstrat, 10 μM für Aurora A oder 5 μM ATP für Aurora B, und 0,2 μCi γ-[³³P]ATP (spezifische Aktivität ≥2.500 Ci/mmol) enthält und dann 60 Minuten bei RT inkubiert wird. Die Reaktionen werden durch Zugabe von 20%iger Phosphorsäure gestoppt, und die Produkte werden auf P30-Nitrozellulosefiltern eingefangen und auf den Einbau von ³³P mit einem Betaplate^TM-Zähler untersucht. Keine Enzym- und keine Verbindungskontrollwerte werden verwendet, um die Konzentration von ZM447439 zu bestimmen, die eine 50%ige Hemmung der Enzymaktivität ergab. Weitere Details sind auf Anfrage bei Nicholas Keen erhältlich.

• Zelllinien

  BON, QGP-1 and MIP-101 cells

• Konzentrationen

  0-5 μM

• Inkubationszeit

  72 hours

• Methode

  Cell number is evaluated by crystal violet staining. In brief, cells in 96-well plates are fixed with 1% glutaraldehyde. Then cells are stained with 0.1% crystal violet. The unbound dye is removed by washing with water. Bound crystal violet is solubilized with 0.2% Triton X-100. Light extinction which increases linearly with the cell number is analyzed at 570 nm using an ELISA reader.