ZSTK474

ZSTK474 reduziert bei 1 μM die PI3K-Aktivität potent auf 4,7 % des Kontrollniveaus, während LY2194002 die Aktivität nur auf 44,6 % der Kontrolle reduziert. Diese Verbindung hemmt die Aktivitäten von rekombinantem p110β, -γ und -δ mit IC50-Werten von 17 nM, 53 nM bzw. 6 nM. Sie zeigt eine potente antiproliferative Aktivität gegen eine Reihe von 39 menschlichen Krebszelllinien mit einem mittleren GI50 von 0,32 μM, effektiver als die von LY294002 oder Wortmannin mit einem mittleren GI50 von 7,4 μM bzw. 10 μM. Diese chemische Behandlung bei 1 μM blockiert die Membranrüschenbildung und die PIP3-Generierung, die durch den aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor in murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs) induziert werden. Bei 10 μM induziert sie Apoptose in OVCAR3-Zellen und induziert einen vollständigen G1-Phasenarrest, aber keine Apoptose in A549-Zellen. Diese Verbindungsbehandlung bei 0,5 μM verringert signifikant den Spiegel von phosphoryliertem Akt und GSK-3β sowie die Cyclin D1-Proteinexpression. Sie hemmt auch die Phosphorylierung anderer nachgeschalteter Signalgebungskomponenten, die an der Regulierung der Zellproliferation beteiligt sind, einschließlich FKHRL1, FKHR, TSC-2, mTOR und p70S6K, in einer dosisabhängigen Weise. [1] Diese Chemikalie hemmt mTOR bei 0,1 μM nicht, und selbst bei einer Konzentration von 100 μM hemmt sie die mTOR-Aktivität um weniger als 40 %. [2] Sie blockiert VEGF-induzierte Zellmigration und die Röhrenbildung in humanen Nabelvenenendothelzellen (HUVECs) und hemmt die Expression von HIF-1α und die Sekretion von VEGF in RXF-631L-Zellen, wobei sie eine potente In-vitro-antiangiogene Aktivität aufweist. [3] Diese Verbindungsbehandlung hemmt die Produktion von IFNγ und IL-17 in Concanavalin A-aktivierten T-Zellen und hemmt die Proliferation und PGE(2)-Produktion durch fibroblastenähnliche Synovialzellen (FLS). [6]

• Hemmung der PI3K-Aktivität

  A549-Zellen werden in einem Puffer, der 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA und 1 % Igepal CA-630 enthält, lysiert, die Lysate werden 10 Minuten lang bei 20.000 g und 4 °C zentrifugiert, und die Überstände werden als Zelllysat (Protein = 2-4 mg/mL) verwendet. Zur Immunpräzipitation von PI3K werden 200 μL Zelllysat mit anti-p85 polyklonalem Antikörper und Protein G-Agarose (5 μL) inkubiert. PI3Kα, PI3Kβ und PI3Kδ können durch den anti-p85 polyklonalen Antikörper immunpräzipitiert werden. Agarose-Kügelchen, die Immunpräzipitate enthalten, werden zweimal mit Puffer A (20 mM Tris-HCl bei pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA und 1 % Igepal CA-630), einmal mit Puffer B (500 mM LiCl und 100 mM Tris-HCl bei pH 7,5), einmal mit destilliertem Wasser und einmal mit Puffer C (100 mM NaCl und 20 mM Tris-HCl bei pH 7,5) gewaschen. Immunpräzipitate werden in 20 μL Puffer C, der Phosphatidylinositol von 200 μg/mL enthält, suspendiert. Die Mischung wird 5 Minuten lang bei 25 °C mit steigenden Konzentrationen dieser Verbindung vorinkubiert. [γ-³²P]ATP (2 μCi pro Assay-Mischung; Endkonzentration, 20 μM) und MgCl₂ (Endkonzentration, 20 mM) werden hinzugefügt, um die Reaktion zu starten. Die Reaktionsmischung wird 20 Minuten lang bei 25 °C inkubiert. Phosphorylierte Produkte von Phosphatidylinositol werden durch Dünnschichtchromatographie getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Phosphatidylinositol-3-Phosphat-Region wird von der Platte abgekratzt, und die Radioaktivität wird auch mit Flüssigszintillationsspektroskopie gemessen. Der Hemmungsgrad für diese Chemikalie wird als Prozentsatz der ³²P-Zählungen pro Minute bestimmt, die ohne diese Verbindung erhalten wurden.

• Zelllinien

  MCF-7, HT-29, HCT-116, OVCAR3, A549, et al.

• Konzentrationen

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Inkubationszeit

  48 hours

• Methode

  Cells are exposed to increasing concentrations of ZSTK474 for 48 hours. The inhibition of cell proliferation is assessed by measuring changes in total cellular protein by use of a sulforhodamine B assay. Apoptosis is assessed by chromatin condensation or by flow cytometry. For chromatin condensation assay, cells are stained with Hoechst 33342 and examined by fluorescence microscopy. Morphologic changes induced by this compound, such as the condensation of chromatin, are indicative of apoptosis. For flow cytometry analysis, cells are harvested, washed with ice-cold PBS, and fixed in 70% ethanol. Cells are then washed twice with ice-cold PBS again, treated with RNase A (500 μg/mL) at 37 °C for 1 hour, and stained with propidium iodide (25 μg/mL). The DNA content of the cells is analyzed with a flow cytometer.

• Tiermodelle

  Male BDF1 mice injected subcutaneously with B16F10 cells, and female BALB/c nude mice inoculated subcutaneously with A549, PC-3, or WiDr cells

• Dosierungen

  ~400 mg/kg/day

• Verabreichung

  Orally