SB203580 (Adezmapimod)

Adezmapimod (SB203580) hemmt die IL-2-induzierte Proliferation primärer menschlicher T-Zellen, muriner CT6-T-Zellen oder BAF F7 B-Zellen mit einer IC50 von 3–5 μm. Es hemmt auch die IL-2-induzierte p70S6-Kinase-Aktivierung, obwohl die erforderliche Konzentration mit einer IC50 über 10 μm etwas höher ist. Diese Verbindung hemmt die Aktivität von PDK1 dosisabhängig mit einer IC50 im Bereich von 3–10 μm. [1] Es hemmt die p38-MAPK-Stimulation von MAPKAPK2 mit einer IC50 von etwa 0,07 μM, während die gesamte SAPK/JNK-Aktivität mit einer IC50 von 3–10 μM gehemmt wird. Bei höheren Konzentrationen aktiviert es den ERK-Signalweg, was anschließend die NF-κB-Transkriptionsaktivität verstärkt. [2] Es induziert auch die Autophagie in menschlichen hepatozellulären Karzinom (HCC)-Zellen. [3]

Adezmapimod (SB203580) schützt das Schweinemyokard in einem In-vivo-Modell vor ischämischer Schädigung. [4] Es ist auch wirksam bei der Prävention und Behandlung der Krankheit im MRL/lpr-Mäusemodell des Systemischen Lupus erythematodes (SLE). [5]

• Zellulärer Rezeptorkinase-Phosphorylierungs-Assay

  4 μg Schafs-Anti-PKBα werden über Nacht (oder 1,5 Stunden) auf 25 μL Protein G-Sepharose immobilisiert und in Puffer A (50 mm Tris, pH 7,5, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 0,5 mm Na₃VO₄, 0,1 % β-Mercaptoethanol, 1 % Triton X-100, 50 mm Natriumfluorid, 5 mm Natriumpyrophosphat, 0,1 mm Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 μg/mL Pepstatin, Leupeptin und 1 μm Microcystin) gewaschen. Das immobilisierte Anti-PKB wird dann 1,5 Stunden lang mit 0,5 ml Lysat (aus 5 × 10⁶ Zellen) inkubiert und dreimal in 0,5 ml Puffer A, ergänzt mit 0,5 m NaCl, zweimal in 0,5 ml Puffer B (50 mm Tris-HCl, pH 7,5, 0,03 % (w/v) Brij-35, 0,1 mm EGTA und 0,1 % β-Mercaptoethanol) und zweimal mit 100 μl Assay-Verdünnungspuffer gewaschen; 5× Assay-Verdünnungspuffer ist 100 mm MOPS, pH 7,2, 125 mm β-Glycerophosphat, 25 mm EGTA, 5 mm Natriumorthovanadat, 5 mm DTT. Zum PKB-Enzym-Immunkomplex werden 10 μL Assay-Verdünnungspuffer, 40 μm Proteinkinase-A-Inhibitorpeptid, 100 μm PKB-spezifisches Substratpeptid und 10 μCi [γ-³²P]ATP gegeben, alles in Assay-Verdünnungspuffer hergestellt. Die Reaktion wird 20 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert, dann werden Proben kurz zentrifugiert und 40 μL Reaktionsvolumen in ein anderes Röhrchen überführt, dem 20 μL 40 %ige Trichloressigsäure zum Stoppen der Reaktion zugesetzt werden. Dies wird gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und 40 μL werden auf P81-Phosphocellulosepapier überführt und 30 Sekunden lang binden gelassen. Das P81-Stück wird dreimal in 0,75 %iger Phosphorsäure und dann in Aceton bei Raumtemperatur gewaschen. Die γ-³²P-Inkorporation wird dann durch Szintillationszählung gemessen.

• Zelllinien

  CT6 cell , BA/F3 F7 cell

• Konzentrationen

  0–30 μM

• Inkubationszeit

  1 hour

• Methode

  CT6 cell and BA/F3 F7 cell are rested by washing three times in RPMI and culturing overnight in RPMI, 5% fetal calf serum in the absence of growth factor, antibiotics, or β-mercaptoethanol supplements. 2–5 × 10⁶ rested CT6 cells are resuspended in 2 mL of RPMI, 5% fetal calf serum and preincubated with Adezmapimod (SB203580) or vehicle control as indicated in figure legends. Cells are then stimulated with 20 ng/ml recombinant human IL-2 for 5 minutes at 37  °C and pelleted in a minifuge for 30 seconds, medium is aspirated, and the pellet is lysed in the appropriate buffer. BA/F3 cells stably expressing deletion mutants of IL-2 receptor β chain are maintained in glutamine containing RPMI further supplemented with 5% fetal calf serum and 0.2 μg/mL G418. The cells are then washed extensively, rested overnight, and washed again before activating with IL-2; such cell preparations are >90% T cells. Cellular proliferation assays are performed by measurement of [³H]thymidine incorporation.

• Tiermodelle

  Systemic lupus erythematosus (SLE) are established in female MRL/lpr mice and female C57BL/6 mice

• Dosierungen

  0.1 M/day

• Verabreichung

  Orally administered