Tivantinib

Es wurde gezeigt, dass ARQ-197 HGF/c-Met-induzierte zelluläre Reaktionen in vitro verhindert. Diese Verbindung besitzt Antitumoraktivität; sie hemmt die Proliferation von A549-, DBTRG- und NCI-H441-Zellen mit IC50-Werten von 0,38, 0,45, 0,29 μM. Die Behandlung mit diesem Agens führt zu einer Abnahme der Phosphorylierung der MAPK-Signaltransduktionskaskade und zur Verhinderung von Invasion und Migration. Darüber hinaus führt die ektopische Expression von c-Met in NCI-H661, einer Zelllinie ohne endogene Expression von c-Met, dazu, dass diese ein invasives Phänotyp erwirbt, das ebenfalls durch diese Chemikalie unterdrückt wird. Obwohl die Zugabe zunehmender Konzentrationen dieses Inhibitors die K_m von ATP nicht signifikant beeinflusst, verringerte die Exposition von c-Met gegenüber 0,5 μM dieser Substanz die V_max von c-Met um ungefähr das 3-fache. Die Fähigkeit dieses Moleküls, die V_max zu verringern, ohne die K_m von ATP zu beeinflussen, bestätigte, dass es c-Met über einen nicht-ATP-kompetitiven Mechanismus hemmt und daher für seine hohe Kinaseselektivität verantwortlich sein könnte. Es verhindert humanes rekombinantes c-Met mit einer berechneten Hemmkonstante K_i von ungefähr 355 nM. Obwohl die höchste verwendete ATP-Konzentration 200 μM beträgt, wird die Potenz dieser Verbindung gegenüber c-Met durch die Verwendung von ATP-Konzentrationen von bis zu 1 mM nicht reduziert. Es blockiert die c-Met-Phosphorylierung und nachgeschaltete c-Met-Signalwege. Diese Chemikalie unterdrückt die konstitutive und Liganden-vermittelte c-Met-Autophosphorylierung und damit die c-Met-Aktivität, was wiederum zur Hemmung nachgeschalteter c-Met-Effektoren führt. Seine Induktion der Caspase-abhängigen Apoptosis ist in c-Met-exprimierenden menschlichen Krebszellen, einschließlich HT29-, MKN-45- und MDA-MB-231-Zellen, erhöht.[1][2]

Alle drei mit Tivantinib behandelten Xenograft-Modelle zeigen eine Reduktion des Tumorwachstums: 66 % im HT29-Modell, 45 % im MKN-45-Modell und 79 % im MDA-MB-231-Modell. In diesen Xenograft-Studien werden keine signifikanten Änderungen des Körpergewichts nach oraler Verabreichung dieser Verbindung in einer Dosis von 200 mg/kg beobachtet. Pharmakodynamisch wird die Phosphorylierung von c-Met in menschlichen Kolon-Xenograft-Tumoren (HT29) durch diese Chemikalie stark gehemmt, wie durch eine drastische Reduktion der c-Met-Autophosphorylierung 24 Stunden nach einer einzelnen oralen Dosis von 200 mg/kg dieses Agens festgestellt wurde. Dieselbe Dosierung bei Mäusen zeigt, dass Tumorxenografts anhaltenden Plasmaspiegeln der Verbindung ausgesetzt sind, was mit der beobachteten pharmakodynamischen Hemmung der c-Met-Phosphorylierung und der Hemmung der Proliferation von c-Met-tragenden Krebszelllinien übereinstimmt. Die Plasmaspiegel des Agens 10 Stunden nach der Dosierung werden auf 1,3 μM bestimmt, mehr als das 3-fache über der biochemischen Hemmkonstante dieser Substanz für c-Met. Daher ist es in der Lage, sein Target in vivo im xenograftierten menschlichen Tumorgewebe zu unterdrücken. Zusammenfassend blockiert dieser Inhibitor das Wachstum von c-Met-abhängigen xenograftierten menschlichen Tumoren.[1]

• c-Met SDS-PAGE In-vitro-Kinase-Assay

  Rekombinantes c-Met-Protein (100 ng) wird 30 Minuten bei Raumtemperatur mit steigenden Konzentrationen dieser Verbindung vorinkubiert. Nach der Vorinkubation werden 100 μM Poly-Glu-Tyr-Substrat und verschiedene ATP-Konzentrationen, die 5 μCi [γ-32P]ATP enthalten, der Reaktionsmischung zugesetzt. Die Reaktion wird 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann durch Zugabe von 5 μL SDS-Polyacrylamidgel, reduzierendem Probenpuffer, gestoppt. Die Proben werden dann auf ein 7,5%iges Acrylamidgel geladen und eine SDS-PAGE durchgeführt. Die phosphorylierten Poly-Glu-Tyr-Substrate werden schließlich durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die c-Met-Aktivität wird durch Densitometrie quantifiziert.

• Zelllinien

  T29, MKN-45 and MDA-MB-231 cells

• Konzentrationen

  0.03-10 μM

• Inkubationszeit

  24, 32, and 48 hours

• Methode

  HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are seeded in black 96-well plates at 5 × 10³ cells per well overnight in a medium with 10% FBS. The next day, cells are treated with increasing concentrations of this compound (0.03-10 μM) for 24, 32, and 48 hours at 37 °C. After this compound treatment, the drug-containing medium is removed and cells are incubated for at least 10 minutes in a labeling solution (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, and 6 mM CaCl₂) containing 2 μg/mL Hoescht 33342 (blue channel), 500-times diluted Annexin V-FITC (green channel), and 1 μg/mL propidium iodide (red channel). High-content image acquisition and analysis are carried out. The program is set to take four images per well. The exposure time is set at 16.7 ms/10% gain, 500 ms/35% gain, and 300 ms/30% gain for the 4,6-diamidino-2-phenylindole, FITC, and rhodamine channels, respectively. Images are processed and the numbers of positive cells for each channel and each condition are determined. In addition, HT29 cells are treated with increasing concentrations of this compound for 32 hours in the absence or the presence of 25, 50, and 100 μM ZvAD-FMK (irreversible general caspase inhibitor), and the same procedures are undertaken. All experiments are done in triplicate. To determine whether the apoptotic effect is due to c-Met inhibition, the effect of this compound when glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and c-Met are knocked down using siRNA is investigated. HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are transfected with a nontargeted control siRNA, a gapgh-targeted control siRNA, or a met-targeted siRNA. After 3 days, c-Met, GAPDH, and β-actin expression levels are determined using specific antibodies. To determine if the effect is caspase dependent, HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are transfected with a met-targeted siRNA for 2 days and incubated in the absence or the presence of increasing concentrations of ZvAD-FMK for 1 additional day. A nontargeted siRNA and a gapgh-targeted siRNA (siRNA GAPDH) are also transfected in parallel, as controls. Cells are then stained with Annexin V-FITC and propidium iodide, and the percentage of apoptotic cells is determined.

• Tiermodelle

  Female athymic nude mice bearing HT29, MKN-45, or MDA-MB-231 tumor xenografts

• Dosierungen

  200 mg/kg

• Verabreichung

  Orally administered