Azilsartan

Ein Radioligandenbindungsassay wird unter Verwendung von menschlichen AT1-Rezeptor-beschichteten Mikrotiterplatten durchgeführt, die 4,4 bis 6,2 fmol Rezeptoren/Well (10 μg Membranprotein/Well) enthalten. Membranbeschichtete Wells werden mit 45 μL Assaypuffer (50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA und 0,005% CHAPS, pH 7,4) inkubiert, der verschiedene Konzentrationen von Azilsartan bei Raumtemperatur enthält. Nach 90 Minuten werden 5 μL ¹²⁵I-Sar¹-Ile⁸-AII (Endkonzentration 0,6 nM), gelöst in Assaypuffer, zu den Wells gegeben und die Platte 5 Stunden lang inkubiert. Bei jedem Schritt wird die Platte kurz und vorsichtig auf einem Plattenschüttler geschüttelt. In Auswaschexperimenten werden die Membranen 90 Minuten lang mit dieser Verbindung inkubiert, dann sofort zweimal mit 200 μL/Well Assaypuffer gewaschen, um ungebundene Verbindungen zu entfernen, und weitere 5 Stunden mit ¹²⁵I-Sar¹-Ile⁸-AII inkubiert. Die membrangebundene Radioaktivität wird mit einem TopCount Microplate Scintillation and Luminescence Counter gezählt. In den Experimenten zur Abschätzung der Dissoziationsrate dieser Chemikalie von AT1-Rezeptoren werden die Membranen 90 Minuten lang mit dieser Verbindung in einer Konzentration von 30 nM für diese Verbindung inkubiert. Diese Verbindung hemmt die spezifische Bindung von ¹²⁵I-Sar¹-Ile⁸-AII an menschliche AT1 um ca. 90%. Die Membranen werden dann sofort zweimal mit 200 μL/Well Assaypuffer gewaschen und weitere 240 Minuten mit ¹²⁵I-Sar¹-Ile⁸-AII inkubiert. Die membrangebundene Radioaktivität wird mit dem TopCount Microplate Scintillation and Luminescence Counter nach 30 Minuten, 60 Minuten, 90 Minuten, 120 Minuten, 150 Minuten, 180 Minuten oder 240 Minuten gezählt. Die unspezifische Bindung von ¹²⁵I-Sar¹-Ile⁸-AII wird in Gegenwart von 10 μM unmarkiertem AII geschätzt. Unmarkiertes AII wird nach dem Auswaschen für das Auswaschexperiment erneut hinzugefügt. Spezifische Bindung wird als Gesamtbindung minus unspezifische Bindung definiert.

COS-7 cells expressing human AT1 receptors

0 μM -1 μM

2 hours

Twenty-four hours after transfections, the COS-7 cells expressing human AT1 receptors are starved by changing the culture medium to starvation buffer (1 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl₂, 4.2 mM KCl, 146 mM NaCl, 5.5 mM glucose, and 10 mM HEPES, pH 7.3). Then, 5 μL/well of Azilsartan dissolved in starvation buffer is added to the cells at the indicated concentrations, and they are pretreated for the indicated times. Two hours after starvation, LiCl is added to a final concentration of 50 mM with or without AII 10 nM, and the cells are further incubated for the indicated times at 37°C. In washout experiments, the cells are washed once with 100 μL/well of starvation buffer to remove unbound this compound before stimulation with AII. The accumulation of inositol 1-phosphate (IP1) is measured by using an IP-One Tb kit. The fluorescence resonance energy transfer signal is measured on a plate reader.

Male Wistar-Kyoto (WKY) rats, obese Koletsky (fak/fak) rats

1 mg/kg, 2 mg/kg and 3 mg/kg

Oral gavage