BIO-acetoxime

Die Kinase-Aktivitäten werden in Puffer A oder C bei 30 °C und einer finalen ATP-Konzentration von 15 μM gemessen. Blindwerte werden subtrahiert und die Aktivitäten als pmol Phosphat berechnet, die während einer 10-minütigen Inkubation eingebaut wurden. Die Aktivitäten werden in % der maximalen Aktivität ausgedrückt, d. h. in Abwesenheit von Inhibitoren. Kontrollen werden mit entsprechenden DMSO-Verdünnungen durchgeführt. GSK-3α/β wird aus Schweinehirn mittels Affinitätschromatographie an immobilisiertem Axin gereinigt. Es wird nach einer 1/100-Verdünnung in 1 mg BSA/mL 10 mM DTT mit 5 μL 40 μM GS-1-Peptid als Substrat in Puffer A in Gegenwart von 15 μM [γ-³³P] ATP (3000 Ci/mmol; 1 mCi/mL) in einem Endvolumen von 30 μL getestet. Nach 30-minütiger Inkubation bei 30 °C werden 25 μL Aliquots des Überstands auf 2,5 × 3 cm große Stücke Whatman P81 Phosphocellulosepapier aufgetragen, und 20 s später werden die Filter fünfmal (jeweils mindestens 5 min) in einer Lösung aus 10 mL Phosphorsäure/Liter Wasser gewaschen. Die nassen Filter werden in Gegenwart von 1 mL ACS-Szintillationsflüssigkeit gezählt. CDK1/Cyclin B wird aus M-Phasen-Seestern (Marthasterias glacialis)-Oozyten in Homogenisierungspuffer extrahiert und mittels Affinitätschromatographie an p9CKShs1-Sepharose-Kügelchen gereinigt, von denen es durch freies p9CKShs1 eluiert wird. Die Kinaseaktivität wird in Puffer C mit 1 mg Histon H1 /mL in Gegenwart von 15 μM [γ-³²P] ATP (3000 Ci/mmol; 1 mCi/mL) in einem Endvolumen von 30 μL bestimmt. Nach 10-minütiger Inkubation bei 30 °C werden 25 μL Aliquots des Überstands auf P81-Phosphocellulosepapiere aufgetragen und wie oben beschrieben behandelt. CDK5/p25 wird durch Mischen gleicher Mengen rekombinanter Säugetier-CDK5 und p25, die in E. coli als GST (Glutathion-S-Transferase)-Fusionsproteine exprimiert und mittels Affinitätschromatographie an Glutathion-Agarose gereinigt wurden, rekonstituiert (p25 ist eine verkürzte Version von p35, dem 35 kDa CDK5-Aktivator). Seine Aktivität wird in Puffer C wie für CDK1/Cyclin B beschrieben gemessen.0

KCN, KCNR, SY5Y, Kelly, and IMR32 cells

~1 μM

72 h

Cell viability is analyzed by CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay according to manufacturer's instructions, approximately 5,000 cells are plated per well of 96-well tissue culture plates with 100 μL of medium. To assess cell viability, rather than proliferation rate, inhibitor- and control-treated cells are assayed after the same growth time had elapsed. The results represent the mean ± SD of triplicate samples, expressed as a percentage of control.