BPTES

BPTES hemmt die in menschlichen Nierenzellen exprimierte Glutaminase-Aktivität mit einer IC50 von 0,18 μM und hemmt den Glutamat-Efflux durch Mikroglia mit einer IC50 von 80-120 nM. [1] Diese Verbindung verlangsamt bevorzugt das Zellwachstum in D54-Zellen mit mutiertem IDH1. Sie hemmt auch die Glutaminase-Aktivität, senkt die Glutamat- und α-KG-Spiegel und erhöht die glykolytischen Intermediate. [2] Diese Chemikalie (10 μM) hemmt das Zellwachstum von mHCC 3–4-Zellen, die aus LAP/MYC-Tumoren stammen. Sie hemmt auch das Wachstum von MYC-abhängigen P493-Zellen, indem sie die DNA-Replikation blockiert, was zum Zelltod und zur Fragmentierung führt. [3]

Bei LAP/MYC-Mäusen verlängert BPTES (12,5 mg/kg, i.p.) das Überleben ohne signifikante Auswirkungen auf die MYC-, GLS- oder GLS2-Spiegel. Diese Verbindung (200 μg/Maus, i.p.) hemmt auch das Tumorzellwachstum bei Mäusen, die P493-Tumor-Xenotransplantate tragen. [3]

• Glutaminase-Hemmung: Zellfreier Assay

  Assay-Platten werden mit 2 μL Testverbindung in DMSO/Well vorbereitet. Das Enzym wird auf 1 Einheit (Leber) oder 0,8 Einheiten (Niere)/100 μL in Glutaminase-Assay-Puffer verdünnt, und 100 μL verdünntes Enzym werden mit Multidrop zu jeder Vertiefung der Assay-Platte gegeben. Der Inhalt wird durch Schütteln bei voller Geschwindigkeit für 1 Minute auf TiterMix 100 gemischt. Die Platten werden bei Raumtemperatur (RT) für 20 Minuten vorinkubiert, um die Bindung der Testverbindungen an Glutaminase zu ermöglichen, und 50 μL Glutaminlösung (7 mM in Assay-Puffer) werden mit Multidrop zu jeder Vertiefung gegeben. Der Inhalt wird für 30 Sekunden bei voller Geschwindigkeit auf TiterMix 100 geschüttelt, und die Platten werden dann bei RT für 60 Minuten (Leber) oder 90 Minuten (Niere) inkubiert. Um die Reaktionen zu stoppen, werden 20 μL HCl (0,3 N) mit Multidrop zu jeder Vertiefung gegeben und sofort durch Schütteln für 30 Sekunden auf TiterMix 100 gemischt. Zur Quantifizierung wird Glutamat (gebildet durch Glutaminase-katalysierte Hydrolyse von Glutamin) durch ein zweites Enzym, die Glutamatdehydrogenase (GDH), zu 2-Oxoglutarat oxidiert, wobei gleichzeitig die reduzierte Form des Nicotinamid-Adenin-Dinukleotids (NADH) entsteht. Die Reduktion von Nitroblau-Tetrazolium (NBT) in der Assay-Lösung durch NADH, katalysiert durch Phenazinmethosulfat (PMS), führt zur Bildung eines blau-violetten Formazans. Die Absorption von Formazan bei 540 nm ist linear proportional zur Glutamatkonzentration bis zu 200 μM. NBT/GDH-Reagenz (50 μL) wird mit Multidrop zu jeder Vertiefung gegeben und durch Schütteln für 30 Sekunden auf TiterMix 100 gemischt, und die Platten werden bei RT für 20 Minuten inkubiert, um die Farbbildung durch die GDH-Reaktion zu ermöglichen. Die Glutamatkonzentration wird aus der Formazan-Konzentration bestimmt, wie sie durch Ablesen der OD540 nm auf einem SpectraMax 340 bestimmt wird.

• Zelllinien

  D54 cells

• Konzentrationen

  --

• Inkubationszeit

  48 h

• Methode

  Cell growth assays are carried out using alamarBlue. Cells are plated at a density of 500 cells/well in a 96-well black clear bottom plate. At 24 hrs, media is changed to the appropriate media (DMEM with 4.5 g/L, 1.5 g/L or 0.1 g/L glucose, 10% FBS, pencillin/streptomycin, and 4 mM glutamine). 48 hours after plating, compounds or DMSO are added. Media and alamarBlue is added to a volume of 200 礚 in each well. Fluorescence is measured at 48 hrs (AOA, this compound) using a Victor3 plate-reader.

• Tiermodelle

  LAP/MYC mice

• Dosierungen

  12.5 mg/kg

• Verabreichung

  i.p.