BX-795

BX-795 blockiert die PDK1-Aktivität in PC-3-Zellen effektiv, wie ihre Fähigkeit zeigt, die Phosphorylierung von S6K1, Akt, PKCδ und GSK3β zu blockieren. Diese Verbindung hemmt das Wachstum von Tumorzellen auf Kunststoff mit einer IC50 von 1,6, 1,4 und 1,9 μM für MDA-468-, HCT-116- bzw. MiaPaca-Zellen. In Weichagar zeigt sie eine höhere Wachstumshemmung mit einer IC50 von 0,72 und 0,25 μM für MDA-468- bzw. PC-3-Zellen. [1]

Darüber hinaus blockiert diese Chemikalie als Inhibitor von TBK1/IKKɛ die TBK1- und IKKε-vermittelte Aktivierung von IRF3 und die Produktion von IFN-β. [2]

In den physiologischen Reaktionen der Blutplättchen wirkt diese Verbindung hemmend auf die 2-MeSADP-induzierte oder kollageninduzierte Aggregation, ATP-Sekretion und Thromboxan-Generierung. [3]

BX-795, ein TBK-1- und PDK-1-Inhibitor, hemmt auch die HSV-Proteintranslation.

• Kinase-Assays

  PDK1 wird in einem direkten Kinase-Assay und einem gekoppelten Assay-Format gemessen, das die PDK1- und PtdIns-3,4-P2-vermittelte Aktivierung von AKT2 misst. Für den gekoppelten Assay enthielt die endgültige Assay-Mischung (60 μL): 15 mM MOPS, pH 7,2, 1 mg/mL Rinderalbumin, 18 mM β-Glycerinphosphat, 0,7 mM Dithiothreitol, 3 mM EGTA, 10 mM MgOAc, 7,5 μM ATP, 0,2 μCi [γ-³³P]ATP, 7,5 μM biotinyliertes Peptidsubstrat (Biotin-ARRRDGGGAQPFRPRAATF), 0,5 μL PtdIns-3,4-P2-haltige Phospholipidvesikel, 60 pg gereinigte rekombinante menschliche PDK1 und 172 ng gereinigte rekombinante menschliche AKT2. Nach Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur wird das biotinylierte Peptid aus 10 μl der Assay-Mischung auf Streptavidin-beschichteten SPA-Kügelchen eingefangen, und die Produktbildung wird durch Szintillationsnähe in einem Wallac MicroBeta-Zähler gemessen. Das gebildete Produkt ist proportional zur Inkubationszeit und zur Menge der hinzugefügten PDK1 und inaktiven AKT2. Diese Verbindung wird in suboptimalen Mengen hinzugefügt, so dass der Assay Inhibitoren der AKT2-Aktivierung sowie direkte Inhibitoren von PDK1 oder AKT2 empfindlich nachweisen könnte. Um die PDK1-Aktivität direkt zu messen, enthielt die endgültige Assay-Mischung (60 μL) 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 0,1 mM EDTA, 0,1% β-Mercaptoethanol, 1 mg/mL Rinderalbumin, 10 mM MgOAc, 10 μM ATP, 0,2 μCi [γ-³³P]ATP, 7,5 μM Substratpeptid (H2N-ARRRGVTTKTFCGT) und 60 ng gereinigte rekombinante menschliche PDK1. Nach 4 h bei Raumtemperatur geben wir 25 mM EDTA hinzu und tupften einen Teil der Reaktionsmischung auf Whatman P81 Phosphozellulosepapier. Das Filterpapier wird dreimal mit 0,75% Phosphorsäure und einmal mit Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen wird das filtergebundene markierte Peptid mit einem Fuji-Phosphorimager quantifiziert.

• Zelllinien

  MDA-468, PC-3, HCT-116 and MiaPaca cells

• Konzentrationen

  ~10 μM

• Inkubationszeit

  72 hours

• Methode

  Cells seeded at a low density (1,500–3,000 cells/well, 0.1 mL/well, 96-well plates) are incubated overnight. Compound treatments are made by adding 10 μL/well of this compound in 1% dimethyl sulfoxide and growth medium (final concentration of dimethyl sulfoxide, 0.1%), followed by brief shaking. Treated cells are incubated for 72 hours, and viability is measured by the addition of 10 μL of the metabolic dye WST-1. The WST-1 signal is read in a plate reader at 450 nm, and a no cell, or zero time cell, background is subtracted to calculate the net signal. Results are reported as the average ± S.E. of two or more replicates.