PR-171 (Carfilzomib)

Carfilzomib (PR-171) hemmt die Proliferation in einer Vielzahl von Zelllinien und von Patienten abgeleiteten neoplastischen Zellen, einschließlich multiplem Myelom, und induzierte intrinsische und extrinsische apoptotische Signalwege sowie die Aktivierung der c-Jun-N-terminalen Kinase (JNK). Es zeigt eine erhöhte Anti-MM-Aktivität, überwindet Resistenzen gegenüber anderen Wirkstoffen und wirkt synergistisch mit (Dex). Diese Verbindung zeigt eine präferenzielle In-vitro-Hemmwirkung gegen die ChT-L-Aktivität in der β5-Untereinheit, mit über 80 % Hemmung bei Dosen von 10 nM. Kurze Exposition gegenüber niedrig dosiertem Carfilzomib führt zu einer präferenziellen Bindungsspezifität für das β5-konstitutive 20S Proteasome und die β5i-Immunproteasome-Untereinheiten. Die Messung der Caspase-Aktivität in mit ihm gepulsten ANBL-6-Zellen zeigt nach 8 Stunden erhebliche Anstiege der Caspase-8-, Caspase-9- und Caspase-3-Aktivität, was eine 3,2-, 3,9- bzw. 6,9-fache Zunahme gegenüber den Kontrollzellen nach 8 Stunden ergibt. In mit Carfilzomib-pulsbehandelten Zellen ist die mitochondriale Membranintegrität auf 41 % (Q1 + Q2) reduziert, verglichen mit 75 % in Vehikel-behandelten Kontrollzellen. [1] In einer anderen Studie hat es auch präklinische Wirksamkeit gegen hämatologische und solide Malignome gezeigt. [2] Es hemmt direkt die Osteoklastenbildung und den Knochenabbau. [3]

Carfilzomib (PR-171) reduziert das Tumorwachstum in einem In-vivo-Xenograft-Modell mäßig. Es verringert die Lebensfähigkeit von multiplem Myelom-Zellen nach kontinuierlicher oder transienter Behandlung effektiv. Diese Verbindung erhöht auch das trabekuläre Knochenvolumen, verringert den Knochenabbau und verbessert die Knochenbildung bei nicht-tumorbelasteten Mäusen. [3]

• Enzymimmunoassays zur Untereinheitenprofilierung von Carfilzomib

  ANBL-6-Zellen (2 × 10⁶/Well) werden in 96-Well-Platten ausgesät und 1 Stunde lang mit Carfilzomib (PR-171) in Dosen von 0,001 bis 10 μM behandelt. Die Zellen werden anschließend lysiert (20 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA) und die geklärten Lysate in Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Platten überführt. Eine Standardkurve wird unter Verwendung unbehandelter ANBL-6-Zelllysate, beginnend mit einer Proteinkonzentration von 6 μg/μL, erstellt. Die aktive Sondenstelle [Biotin-(CH2)4-Leu-Leu-Leu-Epoxyketon; 20 μM] wird hinzugefügt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zelllysate werden dann durch Zugabe von 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und Erhitzen auf 100°C denaturiert, gefolgt von der Mischung mit 20 μL pro Well Streptavidin-Sepharose-Hochleistungsperlen in einer 96-Well-Multiscreen-DV-Platte und einer Inkubation von 1 Stunde. Diese Perlen werden anschließend mit Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA)-Puffer (PBS, 1 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Tween-20) gewaschen und über Nacht bei 4°C auf einem Plattenschüttler mit Antikörpern gegen Proteasome-Untereinheiten inkubiert. Die verwendeten Antikörper umfassten monoklonale Maus-Anti-β1, Anti-β2, Anti-β1i und Anti-β5i, polyklonale Ziegen-Anti-β2i und polyklonale Kaninchen-Anti-β5 (affinitätsgereinigtes Antiserum gegen KLH-CWIRVSSDNVADLHDKYS-Peptid). Die Perlen werden gewaschen und 2 Stunden lang mit Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Ziegen-Anti-Kaninchen-, Ziegen-Anti-Maus- oder Kaninchen-Anti-Ziegen-Antikörpern inkubiert. Nach dem Waschen werden die Perlen unter Verwendung des Supersignal-ELISA-Picochemilumineszenz-Substrats entwickelt. Es wird eine Lumineszenzdetektion durchgeführt. Die Roh-Lumineszenz wird durch Vergleich mit der Standardkurve in μg/mL umgerechnet und als %-Hemmung relativ zur Vehikelkontrolle ausgedrückt. Kurvenanpassungen werden unter Verwendung der folgenden nicht-sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Gleichung erstellt: Y = Boden + (Spitze-Boden)/(1 + 10̂((LogEC50 − X) × HillSlope)), wobei X der Logarithmus der Konzentration, Y die %-Hemmung und EC50 die Dosis dieser Verbindung ist, die einen 50%-Effekt zeigt.

• Zelllinien

  WST-1, ANBL-6 cells

• Konzentrationen

  100 nM

• Inkubationszeit

  1 hour

• Methode

  WST-1 is used to determine the effects of Carfilzomib (PR-171), a proteasome inhibitor, on cell proliferation. The inhibition of proliferation is calculated in relation to parallel control cells that receives vehicle alone. A linear spline function is used to interpolate the median inhibitory concentration (IC50) using XLfit 4 software. The degree of resistance (DOR) is calculated using the formula: DOR = IC50(resistant cells)/IC50(sensitive cells). ANBL-6 cells pulsed with 100 nM of this compound are washed and suspended in PBS containing 5 μg/mL of JC-1, which exhibits potential-dependent accumulation in mitochondria. Analysis of the mitochondrial membrane potential-dependent color shift from 525 to 590 nm is carried out on a FacScan, and the data are analyzed with CellQuest software.

• Tiermodelle

  Beige-nude-XID mice

• Dosierungen

  2.0 mg/kg

• Verabreichung

  i.v.