CHIR-124

CHIR-124 ist ein chinolonbasiertes kleines Molekül, das strukturell nicht mit anderen bekannten Inhibitoren von Chk1 verwandt ist. Diese Verbindung interagiert synergistisch mit Topoisomerase-Giften (z.B. Camptothecin oder SN-38) und führt zu einer Wachstumshemmung in einer Vielzahl von Krebszelllinien, einschließlich Brustkarzinom (MDA-MB-231 und MDA-MB-435) und Darmkarzinom (SW-620 und Colo205), die alle das mutierte p53-Gen enthalten. Es hebt die SN-38-induzierten S- und G2-M Cell Cycle Checkpoints auf und verstärkt die Apoptose in MDA-MD-435 Brustkrebszellen. Die Aufhebung des G2-M Cell Cycle Checkpoints und die Induktion der Apoptose durch diese Chemikalie werden durch den Verlust von p53 verstärkt. [1] Diese Verbindung zielt auch potent auf andere Kinasen wie PDGFR und Flt3 mit IC50 von 6,6 nM bzw. 5,8 nM ab. [2]

CHIR-124 verstärkt die wachstumshemmenden Effekte, indem es den G₂-M Cell Cycle Checkpoint aufhebt und die Tumorapoptose in einem orthotopen Brustkrebs-Xenograftmodell erhöht.

• Chk1 Assay

  Für den Chk1 Assay wird die Kinasedomäne in Sf9-Insektenzellen exprimiert, und ein biotinyliertes cdc25c-Peptid, das die Konsensus-Chk1/Chk2-Phosphorylierungsstelle (*) (Biotin-[AHX]SGSGS*GLYRSPSMP-ENLNRPR[CONH2]) enthält, wird als Substrat verwendet. Eine Verdünnungsreihe von CHIR-124 wird mit einem Kinase-Reaktionspuffer gemischt, der eine Endkonzentration von 30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 4 mM EDTA, 25 mM β-Glycerophosphat, 5 mM MnCl₂, 0,01% Rinderserumalbumin, 1,35 nM CHK1-Kinasedomäne, 0,5 μM Peptidsubstrat und 1 AM unmarkiertes ATP plus 5 nM ³³Pγ-markiertes ATP (spezifische Aktivität = 2.000 Ci/mmol) enthält. Reaktionen und der Nachweis des Phosphattransfers werden mit einer radioaktiven Methode durchgeführt. Die Reaktionen werden 1 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und das phosphorylierte Peptid auf Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten, die einen Stopp-Reaktionspuffer (25 mM EDTA [Ethylendiamintetraessigsäure], 50 mM HEPES, pH 7,5) enthalten, eingefangen. Phosphoryliertes Peptid wird mit dem DELFIA TRF-System unter Verwendung eines Europium-markierten Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers PT66 gemessen. Die Konzentration dieser Verbindung für IC50 wird mittels nichtlinearer Regression mit der XL-Fit-Datenanalysesoftware berechnet.

• Zelllinien

  MDA-MB-231, MDA-MB-435, SW-620, and COLO 205 cells

• Konzentrationen

  0-2350 nM, dependent on cell types

• Inkubationszeit

  48 hours

• Methode

  MDA-MB-231, MDA-MB-435, SW-620, and COLO 205 cells in log-phase are plated into 96-well microplates. CHIR-124 is serially diluted in the presence of six different concentrations of Camptothecin or 0 nM camptothecin. Camptothecin is also serially diluted in the absence of this compound. This chemical is added to cells in 96-well dishes and incubated at 37 °C for 48 hours. Each treatment condition is done in triplicate. Cell proliferation is monitored by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), inner salt assay. MTS inner salt is added to the microplates, which are incubated for another 3 hours, and absorbance at 490 nm is read on a plate reader. The concentrations of each drug in the combinations required to produce 50% inhibition are plotted to generate the isoboles. Isobologram analysis of drug interaction is based the equation of Loewe additivity (1= D _A /IC50, _A + D_B/IC50, _B), where IC50, _A and IC50, _B are the concentrations of drugs to result in 50% inhibition for each drug alone, and D_A and D_B are concentrations of each drug in the combination that yield 50% overall inhibition. A diagonal line indicating Loewe additivity is included in each graph. Data points that fall below the line indicate synergy, whereas those that fall above the line will indicate antagonism

• Tiermodelle

  MDA-MB-435 cells are implanted in the mammary fat pad of 8- to 10-week-old female immunodeficient mice.

• Dosierungen

  10 mg/kg or 20 mg/kg

• Verabreichung

  CHIR-124 is given orally four times daily × 6 on days 2 to 7 in captisol.