CP-673451

CP 673451 ist ein selektiver Inhibitor von PDGFRα/β mit einer IC50 von 10 nM/1 nM und zeigt eine >450-fache Selektivität gegenüber anderen angiogenen Rezeptoren. Bei Glioblastom-Tumoren bewirkt diese Verbindung (33 mg/kg) eine >50%ige Hemmung des PDGFR-β-Rezeptors über 4 Stunden, was einer EC50 von 120 ng/mL im Plasma bei C_max entspricht. In einem Schwamm-Angiogenese-Modell hemmt dieser Inhibitor 70% der PDGF-BB-stimulierten Angiogenese bei einer Dosis von 3 mg/kg (q.d. ×5, p.o., entsprechend 5,5 ng/mL bei C_max).[1] Diese Chemikalie verringert die Zellproliferationsrate durch Mechanismen, die eine reduzierte Phosphorylierung von GSK-3α und GSK-3β umfassen. In sowohl RD- als auch RUCH2-Kulturen beeinträchtigt sie die Rhabdosphären-bildende Kapazität und die Zelldifferenzierung und führt zu einer erhöhten Seneszenz. [2]

CP 673451 (einmal tägliche p.o. ?-Tage-Dosierung routinemäßig) hemmt das Tumorwachstum (ED50 < 33 mg/kg) in einer Reihe von humanen Tumor-Xenografts, die s.c. in athymischen Mäusen gezüchtet wurden, einschließlich H460 humanes Lungenkarzinom, Colo205 und LS174T humane Kolonkarzinome und U87MG humanes Glioblastoma multiforme. [1] In RUCH2-Xenograft-tragenden Mäusen reduziert diese Verbindung das Tumorwachstum und die Infiltration von Stromazellen. [2]

• Kinase-Hemmtest

  Ein Glutathion-S-Transferase-markiertes Kinase-Domänenkonstrukt des intrazellulären Teils des PDGFR-β (Aminosäuren 693-1401, Zugangsnummer J03278) wird in Sf-9-Zellen (Baculovirus-Expressionssystem) exprimiert. Die Enzymkinetik wird bestimmt, indem das Enzym mit zunehmenden ATP-Konzentrationen in Phosphorylierungspuffer [50 mmol/L HEPES (pH 7,3), 125 mmol/L NaCl, 24 mmol/L MgCl₂ in Nunc Immuno MaxiSorp 96-Well-Platten, die zuvor mit 100 μL von 100 μg/mL Poly-Glu-Tyr (Verhältnis 4:1) in PBS verdünnt beschichtet wurden, inkubiert wird. Nach 10 Minuten werden die Platten gewaschen (PBS, 0,1% Tween 20), mit anti-Phosphotyrosin-Meerrettichperoxidase-Antikörper inkubiert und in PBS, 0,05% Tween 20, 3% BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur verdünnt. Die Platten werden wie oben gewaschen und mit 3,3

• Zelllinien

  PAE

• Konzentrationen

  ~3000 nM

• Inkubationszeit

  18 min

• Methode

  PAE cells stably expressing full-length PDGFR and VEGFR have been generated. For cell-based selectivity assays, PAE cells are transfected with fulllength human PDGFR-a, PDGFR-h, or VEGFR-2. Cells are seeded at 4×10⁵ cells/mL in 50 μL growth medium (Ham's F-12 media supplemented with 10% fetal bovine serum, 50,000 units each penicillin and streptomycin. After 6 to 8 hours, the growth medium is replaced with 50 μL serum-depleted medium (as above, but with 0.1% fetal bovine serum) and cells are incubated overnight. Immediately before compound addition, the medium was replaced with 95 μL serum-depleted medium. Compounds are diluted in 100% DMSO, added to the cells at a final DMSO concentration of 0.25% v/v, and incubated at 37°C for 10 minutes. Cells are stimulated with the appropriate ligand and incubated as above for an additional 8 minutes. The medium is removed and the cells washed once with PBS, then lysed with 50 μL HNTG buffer [20 mmol/L HEPES (pH 7.5), 150 mmol/L NaCl, 2% Triton X-100, 10% glycerol, 5 μmol/L EDTA, 2 mmol/L NaVO₄, and 1 EDTA-free complete protease inhibitor tablet per 25 mL] for 5 minutes at room temperature. Lysates are then diluted with 50 μL HG buffer [20 mmol/L HEPES (pH 7.5), 10% glycerol]. The diluted cell lysates are mixed thoroughly, 50 μL of supernatant are transferred to the ELISA capture plate, and incubated at room temperature for 2 hours with agitation. ELISA capture plates are prepared by coating 96-well ReactiBind goat-antirabbit plates with 100 μL/well of 5 μg/mL rabbit anti-human PDGFR-h, anti-PDGFR-a, or anti-VEGFR-2 antibody for 60 to 90 minutes. At the end of the 2-hour incubation the plates are washed (PBS, 0.1% Tween 20) before incubation with anti-phosphotyrosine-horseradish peroxidase antibody (diluted in PBS, 0.05% Tween 20) for 30 minutes at room temperature. The plates are washed again, then incubated with tetramethylbenzidine and evaluated as described above. IC50 values are calculated as percent inhibition of control.

• Tiermodelle

  Athymic female mice

• Dosierungen

  3, 10, or 33 mg/kg

• Verabreichung

  Oral gavage