Crizotinib hydrochloride

PF-2341066 zeigt eine ähnliche Potenz gegen die c-Met-Phosphorylierung in mIMCD3-Maus- oder MDCK-Hunde-Epithelzellen mit IC50-Werten von 5 nM bzw. 20 nM. PF-2341066 zeigt eine verbesserte oder ähnliche Aktivität gegen NIH3T3-Zellen, die zur Expression von c-Met-ATP-Bindungsstellenmutanten V1092I oder H1094R oder der P-Schleifenmutante M1250T konstruiert wurden, mit IC50-Werten von 19 nM, 2 nM bzw. 15 nM, verglichen mit NIH3T3-Zellen, die den Wildtyp-Rezeptor exprimieren, mit einem IC50 von 13 nM. Im Gegensatz dazu wird eine deutliche Verschiebung der Potenz von PF-2341066 gegenüber Zellen beobachtet, die zur Expression von c-Met-Aktivierungsschleifenmutanten Y1230C und Y1235D konstruiert wurden, mit IC50-Werten von 127 nM bzw. 92 nM, verglichen mit dem Wildtyp-Rezeptor. PF-2341066 verhindert auch potent die Phosphorylierung von c-Met in NCI-H69- und HOP92-Zellen mit IC50-Werten von 13 nM bzw. 16 nM, die die endogenen c-Met-Varianten R988C bzw. T1010I exprimieren. PF-2341066 ist >1.000-fach selektiv für die VEGFR2- und PDGFRβ-RTKs, >250-fach selektiv für IRK und Lck und ~40- bis 60-fach selektiv für Tie2, TrkA und TrkB, alles im Vergleich zu c-Met. PF-2341066 ist 20- bis 30-fach selektiv für RON- und Axl-RTKs. Im Gegensatz dazu zeigt PF-2341066 einen nahezu äquivalenten IC50 von 24 nM gegen die onkogene Fusionsvariante der ALK-RTK, Nucleophosmin (NPM)-anaplastische Lymphomkinase (ALK), die von der KARPAS299-Zelllinie für menschliches anaplastisches großzelliges Lymphom (ALCL) exprimiert wird. PF-2341066 hemmt c-Met-abhängige neoplastische Phänotypen von Krebszellen und angiogene Phänotypen von Endothelzellen. PF-2341066 unterdrückt das Wachstum menschlicher GTL-16-Magenkarzinomzellen mit einem IC50 von 9,7 nM. PF-2341066 induziert Apoptose in GTL-16-Zellen mit einem IC50 von 8,4 nM. PF-2341066 hemmt die HGF-stimulierte Migration und Invasion menschlicher NCI-H441-Lungenkarzinomzellen mit IC50-Werten von 11 nM bzw. 6,1 nM. PF-2341066 hemmt die MDCK-Zellstreuung mit einem IC50 von 16 nM. PF-2341066 verhindert die HGF-stimulierte c-Met-Phosphorylierung, das Zellüberleben und die Matrigel-Invasion mit IC50-Werten von 11 nM, 14 nM bzw. 35 nM. Darüber hinaus verhindert PF-2341066 die Serum-stimulierte HMVEC-Verzweigungs-Tubulogenese (Bildung von Gefäßröhrchen) in Fibrin-Gelen.[4]

Im GTL-16-Modell zeigt PF-2341066 die Fähigkeit, eine deutliche Regression großer etablierter Tumoren (>600 mm3) in beiden Behandlungskohorten mit 50 mg/kg/Tag und 75 mg/kg/Tag zu bewirken, mit einer 60%igen Abnahme des mittleren Tumorvolumens über den 43-tägigen Verabreichungsplan. In einer anderen Studie zeigt PF-2341066 die Fähigkeit, das GTL-16-Tumorwachstum für >3 Monate vollständig zu hemmen, wobei nur 1 von 12 Mäusen eine signifikante Zunahme des Tumorwachstums über den 3-monatigen Behandlungsplan bei 50 mg/kg/Tag aufweist. Im NCI-H441-NSCLC-Modell wird eine 43%ige Abnahme des mittleren Tumorvolumens bei 50 mg/kg/Tag während des 38-tägigen PF-2341066-Verabreichungszyklus beobachtet. Im Caki-1-RCC-Modell wird eine 53%ige Abnahme des mittleren Tumorvolumens mit einer Abnahme des Volumens jedes Tumors um mindestens 30 % bei 50 mg/kg/Tag während des 33-tägigen PF-2341066-Verabreichungszyklus in Verbindung gebracht. PF-2341066 zeigt auch eine nahezu vollständige Verhinderung des Wachstums etablierter Tumoren bei 50 mg/kg/Tag in den Glioblastom-U87MG- oder PC-3-Prostatakarzinom-Xenograft-Modellen, mit 97 % bzw. 84 % Hemmung am letzten Studientag. Im Gegensatz dazu hemmt PF-2341066 p.o., das mit 50 mg/kg/Tag verabreicht wird, das Tumorwachstum im MDA-MB-231-Mammakarzinom-Modell oder im DLD-1-Kolonkarzinom-Modell nicht signifikant. Eine signifikante dosisabhängige Reduktion CD31-positiver Endothelzellen wird bei 12,5 mg/kg/Tag, 25 mg/kg/Tag und 50 mg/kg/Tag in GTL-16-Tumoren beobachtet, was darauf hinweist, dass die Hemmung der MVD eine dosisabhängige Korrelation zur Antitumorwirksamkeit zeigt. PF-2341066 zeigt eine signifikante dosisabhängige Reduktion der humanen VEGFA- und IL-8-Plasmaspiegel in den GTL-16- und U87MG-Modellen. Eine deutliche Hemmung der phosphorylierten c-Met-, Akt-, Erk-, PLCλ1- und STAT5-Spiegel wird in GTL-16-Tumoren nach oraler Verabreichung von PF-2341066 beobachtet.[4]

• ELISA-Assays zur Phosphorylierung zellulärer Kinasen

  Zellen werden in 96-Well-Platten in Medien, die mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt sind, ausgesät und nach 24 Stunden in serumfreies Medium [mit 0,04 % Rinderserumalbumin (BSA)] überführt. In Experimenten zur Untersuchung der Liganden-abhängigen RTK-Phosphorylierung werden entsprechende Wachstumsfaktoren für bis zu 20 Minuten hinzugefügt. Nach der Inkubation der Zellen mit PF-2341066 für 1 Stunde und/oder entsprechenden Liganden für die angegebenen Zeiten werden die Zellen einmal mit HBSS, ergänzt mit 1 mM Na₃VO₄, gewaschen und Proteinlysate aus den Zellen gewonnen. Anschließend wird die Phosphorylierung ausgewählter Proteinphosphinasen durch eine Sandwich-ELISA-Methode unter Verwendung spezifischer Fängerantikörper, die zur Beschichtung von 96-Well-Platten verwendet werden, und eines Detektionsantikörpers, der spezifisch für phosphorylierte Tyrosinreste ist, bewertet. Mit Antikörpern beschichtete Platten werden (a) über Nacht bei 4 °C in Gegenwart von Proteinlysaten inkubiert; (b) siebenmal in 1 % Tween 20 in PBS gewaschen; (c) 30 Minuten lang in einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Anti-Gesamt-Phosphotyrosin (PY-20)-Antikörper (1:500) inkubiert; (d) erneut siebenmal gewaschen; (e) in 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin-Peroxidase-Substrat inkubiert, um eine kolorimetrische Reaktion einzuleiten, die durch Zugabe von 0,09 N H₂SO₄ gestoppt wird; und (f) die Absorption bei 450 nm mit einem Spektrophotometer gemessen.

• Zelllinien

  GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells

• Konzentrationen

  0-256 nM

• Inkubationszeit

  1 h

• Methode

  Cells including GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells are seeded in 96-well plates in media supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and transferred to serum-free media [with 0.04% bovine serum albumin (BSA)] after 24 hours. In experiments investigating ligand-dependent RTK phosphorylation, corresponding growth factors are added for up to 20 minutes. After incubation of cells with PF-2341066 for 1 hour and/or appropriate ligands for the designated times, cells are washed once with HBSS supplemented with 1 mM Na₃VO₄, and protein lysates are generated from cells. Subsequently, phosphorylation of selected protein kinases is assessed by a sandwich ELISA method using specific capture antibodies used to coat 96-well plates and a detection antibody specific for phosphorylated tyrosine residues. Antibody-coated plates are (a) incubated in the presence of protein lysates at 4 °C overnight; (b) washed seven times in 1% Tween 20 in PBS; (c) incubated in a horseradish peroxidase–conjugated anti–total-phosphotyrosine (PY-20) antibody (1:500) for 30 min; (d) washed seven times again; (e) incubated in 3,3^′,5,5^′-tetramethyl benzidine peroxidase substrate to initiate a colorimetric reaction that is stopped by adding 0.09 N H₂SO₄; and (f) measured for absorbance in 450 nm using a spectrophotometer.

• Tiermodelle

  Female or male nu/nu mice bearing NCI-H441,or DLD-1, or MDA-MB-231

• Dosierungen

  12.5 mg/kg/day, 25 mg/kg/day, and 50 mg/kg/day

• Verabreichung

  p.o.