Cyclosporin A

Cyclosporin A bindet an das Cyclophilin (Immunophilin) in T-Zellen[1], bildet einen Cyclophilin-diesen Verbindungskomplex, der an Calcineurin bindet und es hemmt. [2] Diese Chemikalie hemmt Calcineurin mit einer IC50 von 7 nM[3] und blockiert dann die nukleäre Translokation von NF-AT. [4] Es beeinflusst auch Mitochondrien, indem es die Öffnung des MTP (mitochondrialer Permeabilitätsübergangspore) mit einer IC50 von 39 nM verhindert. [5]

Cyclosporin A ist ein immunsuppressiver Wirkstoff, der sowohl nach parenteraler als auch nach oraler Verabreichung bei Mäusen, Ratten und Meerschweinchen wirksam ist. [6] wird klinisch bei Organtransplantationen eingesetzt, um Abstoßungen zu verhindern. [7]

• Phosphatase-Assay

  Gereinigtes Rinderhirn-Calcineurin und Calmodulin werden gekauft. Reaktionsgemische mit gereinigtem Enzym enthalten 100 nM Calcineurin, 100 nM Calmodulin und 5 μM ³²P-markiertes Phosphopeptid in 60 μl (Gesamtvolumen) Assay-Puffer, der 20 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCI, 6 mM MgCl₂, 0,5 mM Dithiothreit, 0,1 mg Rinderserumalbumin pro ml und entweder 0,1 mM CaCl₂ oder 5 mM EGTA enthält. Reaktionsgemische mit Zelllysaten enthalten 20 μl unverdünntes Lysat, 5 μM ³²P-markiertes Phosphopeptid und 40 μl Assay-Puffer. Wo angegeben, enthalten die Reaktionsgemische 50 μM Peptid 412 oder 413 und/oder 500 nM Okadainsäure, einen spezifischen Inhibitor der Phosphatasen 1 und 2A; 500 nM Okadainsäure ist ausreichend für die Hemmung von Ca²⁺-unabhängigen Phosphatasen, während höhere Konzentrationen auch Ca²⁺-abhängige Aktivität teilweise hemmen. Nach 15 Minuten bei 30°C werden die Reaktionen durch Zugabe von 0,5 ml 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), der 5% Trichloressigsäure enthält, beendet. Freies anorganisches Phosphat wird durch Dowex-Kationenaustauschchromatographie isoliert und durch Szintillationszählung wie beschrieben quantifiziert.

• Zelllinien

  Jurkat cells (clone J77)

• Konzentrationen

  ~100 nM

• Inkubationszeit

  1 hr

• Methode

  Immunosuppressive agents are dissolved in ethanol at concentrations 1000-fold more than the concentration desired for cell treatments. Cells (10⁶) are suspended in 1 ml of complete medium in microcentrifuge tubes; 1 μl of ethanol or of the ethanolic solution of Cyclosporin A is added, and the cells are incubated at 37°C for 1 hr. Cells are washed twice with 1 ml of PBS on ice and lysed in 50μl of hypotonic buffer containing 50 mM Tris (pH 7.5); 0.1 mM EGTA; 1 mM EDTA; 0.5 mM dithiothreitol; and 50 μg of phenylmethylsulfonyl fluoride, 50 μg of soybean trypsin inhibitor, 5 μg of leupeptin, and 5 μg of aprotinin per ml. Lysates are subjected to three cycles of freezing in liquid nitrogen followed by thawing at 30°C and then are centrifuged at 4°C for 10 min at 12,000×g.

• Tiermodelle

  Rat

• Dosierungen

  45 mg/kg

• Verabreichung

  orally