DAPT

Menschliche embryonale Nierenzellen (American Type Culture Collection CRL-1573), transfiziert mit dem Gen für APP751 (HEK 293), werden für routinemäßige Aβ-Reduktionsassays verwendet. Zellen werden in 96-Well-Platten ausgesät und über Nacht in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum adhärieren gelassen. DAPT wird aus Stammlösungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) verdünnt, um eine Endkonzentration von 0,1 % DMSO im Medium zu erreichen. Zellen werden 2 Stunden lang bei 37 °C mit dieser Verbindung vorbehandelt, das Medium wird abgesaugt und frische Verbindungslösungen werden aufgetragen. Nach einer weiteren Behandlungsdauer von 2 Stunden wird das konditionierte Medium entnommen und mittels eines Sandwich-ELISA (266–3D6), der spezifisch für gesamtes Aβ ist, analysiert. Die Reduktion der Aβ-Produktion wird relativ zu Kontrollzellen gemessen, die mit 0,1 % DMSO behandelt wurden, und als prozentuale Hemmung ausgedrückt. Daten von mindestens sechs Dosen in Duplikaten werden mit der XLfit-Software an ein Vier-Parameter-Logistikmodell angepasst, um die Potenz zu bestimmen. Menschliche und PDAPP-Maus-Neuronen-Kulturen werden in serumfreiem Medium kultiviert, um ihre neuronalen Eigenschaften zu verbessern, und schienen nach der Reifung vor der Verwendung zu über 90 % aus Neuronen zu bestehen. Konditionierte Medien zur Bestimmung der Aβ-Basalwerte werden gesammelt, indem frisches Medium zu jedem Well gegeben und 24 Stunden lang bei 37 °C in Abwesenheit dieser Chemikalie inkubiert wird. Die Kulturen werden dann weitere 24 Stunden bei 37 °C mit frischem Medium, das diese Verbindung in der gewünschten Konzentrationsreihe enthält, behandelt und konditionierte Medien gesammelt. Für die Messung des gesamten Aβ werden die Proben mit demselben ELISA (266–3D6) analysiert, der auch für die HEK 293-Zellassays verwendet wurde. Analysen von Proben auf Aβ42-Produktion werden mit einem separaten ELISA (21F12–3D6) durchgeführt, der einen Fängerantikörper verwendet, der spezifisch für den Aβ42 C-Terminus ist. Die Hemmung der Produktion sowohl des gesamten Aβ als auch des Aβ42 wird durch die Differenz zwischen den Werten für die Verbindung Behandlung und die Basalperioden bestimmt. Nach dem Auftragen der prozentualen Hemmung gegen diese Verbindungskonzentration werden die Daten wie oben mit der XLfit-Software analysiert, um die Potenz zu bestimmen.

SK-MES-1

2.5 μM to 160 μM

72 hours

Cells are seeded into 96-well plates and exposed to 0.1% DMSO or DAPT at concentrations in the range of 2.5 μM–160 μM for 72 hours. Cytotoxicity is determined with 3-(4, 5)-dimethylthiahiazo-(-z-y1)-3, 5-di-phenytetrazoliumromide (MTT) dye reduction assay with minor modifications. Briefly, after incubation with this compound, 20 μL MTT solution (5 mg/mL in PBS) is added to 180 μL medium in each well and plates are incubated for 4 hours at 37 °C, and subsequently 150 μL DMSO is added to each well, and mixed by shaking at room temperature for 15 minutes. Absorption is measured by an enzyme-linked immunosorbent assay at 490 nm to determine absorbance values. α-MEM supplemented with the same amount of MTT solution and solvent is used as blank solution. The IC50 value is calculated using PROBIT program in SPSS.

Heterozygous PDAPP transgenic mice overexpressing the APPV717F mutant form of the amyloid precursor protein.

≤100 mg/kg

Administered via p.o.