Rebastinib (DCC-2036)

Die Aktivität von u-Abl1native wird durch Verfolgung der ADP-Produktion aus der Kinase-Reaktion über die Kopplung mit dem Pyruvatkinase/Laktatdehydrogenase-System bestimmt. In diesem Assay wird die Oxidation von NADH (gemessen als abnehmende A340nm) kontinuierlich spektrophotometrisch überwacht. Die endgültige Reaktionsmischung (100 μL in einer 384-Well-Corning-Platte) wird wie folgt hergestellt: Eine Abl1-Kinase/gekoppelte Assay-Komponentenmischung wird hergestellt, die u-Abl1-Kinase (1 nM), Abltide (EAIYAAPFAKKK, 0,2 mM), MgCl₂ (9 mM), Pyruvatkinase (~ 4 Einheiten), Laktatdehydrogenase (~ 0,7 Einheiten), Phosphoenolpyruvat (1 mM) und NADH (0,28 mM) in 90 mM Tris, das 0,1 % Octylglucosid und 1 % DMSO enthält, pH 7,5, enthält. Separat wird eine Inhibitor-Mischung hergestellt, die Rebastinib (DCC-2036) enthält, das 3-fach in DMSO seriell verdünnt und anschließend in einen Puffer, bestehend aus 180 mM Tris, pH 7,5, mit MgCl₂ (18 mM) und 0,2 % Octylglucosid, verdünnt wird. Fünfzig μL der Inhibitor-Mischung werden mit 50 μL der oben genannten Abl1-Kinase/gekoppelten Assay-Komponentenmischung gemischt, die dann 2 Stunden lang bei 30 °C inkubiert wird, bevor 2 μL von 25 mM ATP (500 μM, Endkonzentration) hinzugefügt werden, um die Reaktion zu starten. Die Reaktion wird alle 2 Minuten für 2,5 Stunden bei 30 °C auf einem Polarstar Optima oder Synergy2 Plattenleser aufgezeichnet. Die Reaktionsrate (Steigung) wird unter Verwendung des Zeitrahmens von 1 bis 2 Stunden mit der Software des Lesegeräts berechnet. Die prozentuale Hemmung wird durch Vergleich der Reaktionsrate mit der einer DMSO-Kontrolle erhalten. IC50-Werte werden aus einer Reihe von prozentualen Hemmwerten, die bei verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen bestimmt wurden, mit GraphPad Prism berechnet. Der Kinase-Assay für Abl1T315I, p-Abl1native oder Abl1H396P wird wie oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 2,2 nM Abl1T315I, 1 nM p-Abl1 native oder 1,3 nM Abl1H396P verwendet wird. Das oben genannte Assay-Format wird auch für andere Kinasen als Abl1 verwendet, mit Ausnahme von TIE2, für das ein Fluoreszenzpolarisation/Transcreener-Format verwendet wird. Die Assay-Bedingungen sind die gleichen wie oben beschrieben, außer dass PolyE4Y (final 1 mg/mL) als Substrat verwendet und eine Stunde Präinkubation durchgeführt wird.

Ba/F3 cells and primary Ph⁺ leukemia cells

0-10 μM

72 hours

Ba/F3 cells or primary Ph⁺ leukemia cells are plated in triplicate in 96-well plates containing test compounds. After 72 hours, viable cells are quantified by Resazurin or MTT assay. Cells are diluted in medium to be added to each well of a 96-well tissue culture-treated plate. All cells are incubated overnight and maintained in a humidified atmosphere at 37 °C and 5% CO₂. Cells are treated the following day. Serum-free medium is used during treatment with Rebastinib (DCC-2036). MTT is used to assess the viability of cells following treatment. Aliquots of 20 mL of stock MTT solution are added to each well containing 200 mL of medium (10% final solution) and incubated with the cells for 2 hours. Following incubation the medium is removed and 200 mL of dimethylsulfoxide added to solubilize the formazan crystals. The absorbance is read on the plate reader at 550 and 690 nm. A subtraction analysis of the dual wavelength is performed (D550 to D690) to increase accuracy of the measurement.

Ba/F3 cells transformed to interleukin-3 independence by transduction with either Bcr-Abl1^native or Bcr-Abl1^T315I retrovirus are injected intravenously into syngeneic Balb/c mice.

≤100 mg/kg

Administered via p.o.