Dinaciclib (SCH 727965)

Dinaciclib ist auch ein potenter DNA-Replikationshemmer, der die dThd-DNA-Inkorporation in A2780-Zellen mit einer IC50 von 4 nM blockiert. Diese Verbindung unterdrückt die Phosphorylierung von Rb an Ser 807/811 bei Konzentrationen >6,25 nM stark, was mit der Beobachtung übereinstimmt, dass 4 nM Konzentrationen für eine 50%ige Hemmung der dThd-DNA-Inkorporation im selben Zellmodell erforderlich sind. Eine signifikante, vollständige Unterdrückung der Rb-Phosphorylierung korreliert mit dem Einsetzen der Apoptose, wie durch das Auftreten des p85 PARP-Spaltprodukts in Zellen angezeigt wird, die >6,25 nM dieser Chemikalie ausgesetzt waren. Sie ist wirksam gegen ein breites Spektrum menschlicher Tumorzelllinien. [1] Die Zugabe dieser Verbindung während der Exposition unterdrückt auch die Akkumulation von γ-H2AX dosisabhängig. [2] Sie hemmt die Proliferation von Melanomzellen und treibt Melanomzellen in massive Apoptose. [3] Diese Chemikalie induziert die Apoptose mehrerer Osteosarkom-Zelllinien, einschließlich derer, die gegen Doxorubicin resistent sind. Sie schwächt die Phosphorylierung von RNAP II an Serin 2 und die Phosphorylierung des CDK-Inhibitors p27^Kip1 an Threonin 187 ab. Reduktionen der Phosphorylierungsaktivität treten bei 12–40 nM dieser Verbindung auf (4 bis 16 Stunden nach Zugabe). Sie reduziert auch die Phosphorylierung von Rb an Serin 807/811. Diese Chemikalie induziert die Apoptose von Mock- und p53-depletierten U2OS-Zellen in ähnlichem Ausmaß. [4]

Die i.p.-Verabreichung von Dinaciclib in Dosen von 8, 16, 32 und 48 mg/kg täglich über 10 Tage führt zu einer Tumorhemmung von 70 %, 70 %, 89 % bzw. 96 %. Die MED (minimale effektive Dosis) dieser Verbindung scheint <8 mg/kg zu betragen. Sie wird gut vertragen, und der maximale Körpergewichtsverlust in der höchsten Dosierungsgruppe beträgt 5 %. Diese Chemikalie besitzt dosisabhängige Antitumoraktivität in vivo, und eine nahezu vollständige Hemmung des Tumorwachstums tritt bei einer Dosis unterhalb der MTD (maximal tolerierten Dosis) auf. Sie hat eine kurze Plasmahalbwertszeit bei Mäusen. [1]

• Cyclin/CDK Kinase-Assay

  Rekombinante Cyclin/CDK-Holoenzyme werden aus Sf9-Zellen gereinigt, die zur Produktion von Baculoviren konstruiert wurden, die ein spezifisches Cyclin oder CDK exprimieren. Cyclin/CDK-Komplexe werden typischerweise auf eine Endkonzentration von 50 μg/mL in einem Kinase-Reaktionspuffer verdünnt, der 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT und 0,1 mM Natriumorthovanadat enthält. Für jede Kinase-Reaktion werden 1 μg Enzym und 20 μL einer 2-μM Substratlösung (ein biotinyliertes Peptid, das von Histon H1 abgeleitet ist) gemischt und mit 10 μL der verdünnten Verbindung kombiniert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 μL 2 μM ATP und 0,1 μCi ³³P-ATP gestartet. Kinase-Reaktionen werden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und durch Zugabe von 0,1 % Triton X-100, 1 mM ATP, 5 mM EDTA und 5 mg/mL Streptavidin-beschichteten SPA-Beads gestoppt. SPA-Beads werden mit einer 96-Well GF/B-Filterplatte und einem Filtermate Universal Harvester eingefangen. Die Beads werden zweimal mit 2 M NaCl und zweimal mit 2 M NaCl, das 1 % Phosphorsäure enthält, gewaschen. Das Signal wird dann mit einem TopCount 96-Well Flüssigszintillationszähler gemessen.

• Zelllinien

  A2780 cells

• Konzentrationen

  0 μM -5 μM

• Inkubationszeit

  24 hours

• Methode

  A2780 cells are maintained in DMEM plus 10% fetal bovine serum and passaged twice weekly by detaching the monolayer with trypsin-EDTA. One hundred microliters of A2780 cells (5 × 10³ cells) are added per well to a 96-well Cytostar-T plate and incubated for 16 hours to 24 hours at 37 °C. Dinaciclib is serially diluted in complete media plus 2% ¹⁴C-labeled dThd. Media are removed from the Cytostar T plate; 200 μL of various this compound dilutions are added in quadruplicate; and the cells are incubated for 24 hours at 37 °C. Accumulated incorporation of radiolabel is assayed using scintillation proximity and measured on a TopCoun^TM.

• Tiermodelle

  Nude mice bearing A2780 tumors

• Dosierungen

  8 mg/kg, 16 mg/kg, 32 mg/kg, and 48 mg/kg

• Verabreichung

  Administered via i.p.