Dyngo-4a (Hydroxy-Dynasore)

Die Dynamin-I-Aktivität wird in ihrem SAI-Aktivitätszustand gemessen oder durch drei verschiedene Methoden stimuliert. Da jeder Stimulus Dynamin in unterschiedlichem Ausmaß aktiviert, erfordert jeder Assay unterschiedliche Dynaminkonzentrationen. Zunächst wird die maximale Dynamin-Aktivität durch sonifizierte PS-Liposomen stimuliert. Gereinigtes Dynamin I (10–20 nM, verdünnt in: 6 mM Tris–HCl, 20 mM NaCl und 0,01 % Tween 80, pH 7,4) wird in 96-Well-Platten in GTPase-Puffer (5 mM Tris–HCl, 10 mM NaCl, 2 mM Mg²⁺, 0,05 % Tween 80, pH 7,4, 1 µg/mL Leupeptin und 0,1 mM PMSF) und 0,3 mM GTP in Gegenwart der Testsubstanz für 30 Min. bei 37 °C in einem endgültigen Assayvolumen von 150 μL inkubiert. Die Reaktionen werden mit 10 μL 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 7,4 beendet und Malachitgrün-Lösung (40 μL: 2 % (w/v) Ammoniummolybdat-Tetrahydrat, 0,15 % (w/v) Malachitgrün und 4 M HCl) wird für 5 Min. hinzugefügt. Zweitens wird Dynamin (20 nM) durch 10 µg/mL Taxol-stabilisierte, vorgeformte Mikrotubuli aus Rinderhirn unter Verwendung des gleichen Protokolls stimuliert. Drittens wird Dynamin I (50 nM) durch 1 μM rekombinantes grb2 stimuliert, ein SH3-enthaltendes Protein, das Dynamin etwa 5–10-mal weniger effizient stimuliert als Liposomen oder Mikrotubuli. Schließlich wird die SAI-Aktivität von Dynamin (500 nM) unter Verwendung hoher Dynaminkonzentrationen gemessen, die dessen kooperative Selbstassemblierung zu Ringen (aber nicht zu Helices) fördern. Die endgültige DMSO-Konzentration in den GTPase- oder Endozytose-Assays beträgt höchstens 3,3 bzw. 1 %, typischerweise jedoch 1 %. Der GTPase-Assay für Dynamin I wird durch DMSO bis zu 3,3 % nicht beeinflusst. Verbindungen werden als 30 mM Stammlösungen in 100 % DMSO gelöst. Diese Stammlösungen können bei –20 °C für mehrere Monate gelagert werden. Verbindungen werden anschließend in Lösungen von 50 % DMSO, hergestellt in 20 mM Tris–HCl pH 7,4, verdünnt und erneut in den endgültigen Assay verdünnt. Zur Analyse der Kinetik dieser Verbindungshemmung wird Dynamin I in einer Endkonzentration von 17 nM mit GTPase-Puffer, der PS (2 µg/mL) und variierende Mengen an GTP (50–250 μM) enthält, in Gegenwart dieser Chemikalie in einem Konzentrationsbereich zwischen 0,5 und 6 μM inkubiert. Die Reaktion wird nach 30 Min. durch Zugabe von EDTA (0,5 mM, pH 7,4) gestoppt. Kurven werden unter Verwendung der Michaelis-Menten-Gleichung v = Vmax[S]/(Km + [S]) erstellt, wobei S das GTP-Substrat ist. Nachdem die Vmax- und Km-Werte bestimmt wurden, wurden die Daten unter Verwendung der Lineweaver-Burke-Gleichung 1/v = 1/Vmax + (Km/Vmax)(1/[S]) transformiert. Die Assay-Bedingungen basieren auf dem Dynamin-I-Assay, enthielten jedoch Modifikationen. Rekombinantes Dynamin II wird bei 50 nM verwendet, stimuliert durch 10 µg/mL PS. Die GTPase-Reaktion darf 90 Min. bei 37 °C ablaufen, bevor sie beendet wird.

αT3–1 or LβT2 cells

30 μM

30 minutes

αT3-1 or LβT2 cells (2 × 10⁶) were grown overnight in a 6-well culture dish and then serum starved for 2–4 hours. Cells were pretreated with either vehicle (0), dynasore (80μM), or dyngo (30μM) for 30 minutes. For dose-response studies, indicated doses of this compound were used for a 30-minute pretreatment. After pretreatment, cells were treated with 0 or GnRHa (10 nM) for 10 minutes. Cells were then washed twice in PBS, lysed in radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer and subjected to SDS-PAGE (acrylamide:bis-acrylamide ratio of 29:1) and electroblotted to polyvinylidene difluoride membranes.

Female CD-1 mice

30 mg/kg

i.p.