Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC)

1.Proteinpräparation
1) Um den besten Markierungseffekt zu erzielen, bereiten Sie die Protein-(Antikörper-)Konzentration als 2 mg/mL vor.
2) Der pH-Wert der Proteinlösung sollte 8,5 ± 0,5 betragen. Wenn der pH-Wert niedriger als 8,0 ist, sollte 1m Natriumbicarbonat zur Einstellung verwendet werden.
3) Wenn die Proteinkonzentration niedriger als 2 mg/ml ist, wird die Markierungseffizienz stark reduziert. Um die beste Markierungseffizienz zu erzielen, wird empfohlen, dass der endgültige Proteinkonzentrationsbereich 2-10 mg/mL beträgt.
4) Das Protein muss in einem Puffer ohne primäres Amin (wie Tris oder Glycin) und Ammoniumionen vorliegen, da sonst die Markierungseffizienz beeinträchtigt wird.
2.Farbstoffpräparation
Geben Sie wasserfreies DMSO in das Fläschchen mit Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC), um eine 10 mM Stammlösung herzustellen. Gut mischen durch Pipettieren oder Vortexen.
3.Berechnung der Farbstoffdosierung
Die für die Reaktion benötigte Menge dieser Verbindung hängt von der Menge des zu markierenden Proteins ab, und das optimale molare Verhältnis von ihr zu Protein beträgt etwa 10.
Beispiel: Angenommen, das erforderliche Markerprotein beträgt 1 mL 2 mg/mL IgG (MW=150.000), verwenden Sie 1 mL DMSO, um 1 mg FITC zu lösen, das erforderliche Volumen beträgt 40 μL.
4.Konjugationsreaktion durchführen
1) Eine gute Menge frisch zubereitetes 10 mg/mL FITC wird langsam zu 0,5 mL Proteinprobe gegeben. In Lösung vorsichtig schütteln, um zu mischen, dann kurz zentrifugieren, um die Probe am Boden des Reaktionsröhrchens zu sammeln. Nicht gut mischen, um eine Denaturierung und Inaktivierung der Proteinproben zu verhindern.
2) Die Reaktionsröhrchen wurden an einem dunklen Ort platziert und bei Raumtemperatur 60 Minuten lang in Intervallen vorsichtig inkubiert. Alle 10-15 Minuten die Reaktionsröhrchen mehrmals vorsichtig umdrehen, um die beiden Reaktanten vollständig zu mischen und die Balkeneffizienz zu erhöhen.
5.Konjugat reinigen
Das folgende Protokoll ist ein Beispiel für die Reinigung eines Farbstoff-Protein-Konjugats mittels einer Sephadex G-25-Säule.
1) Bereiten Sie die Sephadex G-25-Säule gemäß der Herstelleranleitung vor.
2) Laden Sie die Reaktionsmischung (aus „Reaktionskonjugation durchführen“) auf die Oberseite der Sephadex G-25-Säule.
3) Fügen Sie PBS (pH 7,2-7,4) hinzu, sobald die Probe knapp unter die obere Harzoberfläche läuft.
4) Fügen Sie mehr PBS (pH 7,2-7,4) zur gewünschten Probe hinzu, um die Säulenreinigung abzuschließen.
Kombinieren Sie die Fraktionen, die das gewünschte Farbstoff-Protein-Konjugat enthalten.