GSK2606414

Diese Verbindung hemmt die PERK-Autophosphorylierung in A459-Zellen mit einer IC50 von <0,3 μM. [1]

GSK2606414 weist eine hohe orale Bioverfügbarkeit und eine geringe bis moderate Blutclearance bei Maus, Ratte und Hund auf. Diese oral verabreichte Verbindung hemmt das Tumorwachstum dosisabhängig in Mäusen mit pankreatischen humanen BxPC3-Tumoren. [1]

• PKR-ähnliche Endoplasmatisches Retikulum Kinase (PERK) Assay (HTRF-Format)

  Die zytoplasmatische Domäne von GST-PERK wird käuflich erworben. 6-His-Volllängen-Human-eIF2α wird aus Baculovirus-Expression in Sf9-Insektenzellen gereinigt. Das eIF2α-Protein wird durch Dialyse in PBS umgepuffert, chemisch durch NHS-LC-Biotin modifiziert und anschließend durch Dialyse in 50 mM Tris, pH 7,2, 250 mM NaCl, 5 mM DTT umgepuffert. Das Protein wird aliquotiert und bei –80 °C gelagert. Die Quench-Lösung wird frisch zubereitet und ergibt bei Zugabe zur Reaktion Endkonzentrationen von 4 nM eIF2α-Phospho-Ser51-Antikörper, 4 nM Eu-1024-markiertem Anti-Kaninchen-IgG, 40 nM Streptavidin Surelight APC und 15 mM EDTA. Die Reaktionen wurden in schwarzen 384-Well-Polystyrol-Low-Volume-Platten in einem Endvolumen von 10 μL durchgeführt. Das Reaktionsvolumen enthält in Endkonzentrationen 10 mM HEPES, 5 mM MgCl₂, 5 μM ATP, 1 mM DTT, 2 mM CHAPS, 40 nM biotinyliertes 6-His-eIF2α und 0,4 nM GST-PERK. Die zu analysierenden Verbindungen werden in DMSO auf 1,0 mM gelöst und seriell 1–3 mit DMSO über 11 Verdünnungen verdünnt. Eine Menge von 0,1 μL jeder Konzentration wird in das entsprechende Well einer Assay-Platte überführt. Dies erzeugt einen Endkonzentrationsbereich der Verbindung von 0,00017 bis 10 μM. Die GST-PERK-Lösung wird zu den Assay-Platten mit Verbindungen gegeben und 30 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von ATP und eIF2α-Substratlösung initiiert. Nach 1 Stunde Inkubation wird die Quench-Lösung hinzugefügt. Die Platten werden 2 Stunden bei Raumtemperatur abgedeckt, bevor das Signal bestimmt wird. Das resultierende Signal wird auf einem Viewlux-Lesegerät quantifiziert. Das APC-Signal wird durch Transformation der Daten mittels einer APC/Eu-Berechnung auf das Europium-Signal normalisiert. Die Daten für die Konzentrations-Wirkungs-Kurven werden als % Hemmung, berechnet mit der Datenreduktionsformel 100 × [1 – (U1 – C2)/(C1 – C2)], gegenüber der Konzentration der Verbindung aufgetragen, wobei U der unbekannte Wert, C1 der durchschnittliche Kontrollwert für 1% DMSO und C2 der durchschnittliche Kontrollwert für 0,1 M EDTA ist. Die Daten werden mit einer Kurve angepasst, die beschrieben wird durch , wobei A die minimale Reaktion, B die maximale Reaktion, D der Steigungsfaktor, x die Konzentration der Verbindung und C die IC50 ist. Die Ergebnisse für jede Verbindung werden als IC50-Werte aufgezeichnet.

• Zelllinien

  A549 cells

• Konzentrationen

  0.3 μM

• Inkubationszeit

  2 h

• Methode

  Cells were incubated with PERK inhibitor (GSK2606414, compound 38) and then stimulated with thapsigargin. After 2 h, the cells were lysed and analyzed for inhibition of PERK autophosphorylation.

• Tiermodelle

  BxPC3 human pancreatic xenograft model

• Dosierungen

  ~150 mg/kg

• Verabreichung

  Oral administration