GSK343

GSK343 hemmt die Trimethylierung von H3K27 (H3K27me3) mit einer IC50 von 174 nM in HCC1806-Brustkrebszellen. Diese Verbindung hemmt potent die Zellproliferation in Brustkrebszellen und Prostatakrebszellen, wobei die Prostatakrebszelllinie LNCaP mit einer IC50 von 2,9 μM am empfindlichsten ist. [1]

Diese Chemikalie unterdrückt signifikant das Wachstum von EOC-Zellen, die in 3D-Matrigel-Extrazellulärmatrix (ECM) kultiviert wurden, die die Tumormikroumgebung in vivo nachahmt. Darüber hinaus induziert sie auch die Apoptose von EOC-Zellen in 3D und hemmt signifikant die Invasion von EOC-Zellen. [2]

GSK343, ein selektiver EZH2-Inhibitor, hemmt die Phagozytose.

• In-vitro-biochemische Assays gegen Histone Methyltransferase

  Die Aktivität gegen EZH2 wird unter Verwendung eines 5-gliedrigen PRC2-Komplexes (Flag-EZH2, EED, SUZ12, AEBP2, RbAp48) bewertet. Das Assay-Protokoll kann wie folgt zusammengefasst werden: 10 mM Stammlösungen von Verbindungen werden aus Feststoff in 100% DMSO hergestellt. Eine 11-Punkt-Serienverdünnungs-Masterplatte wird im 384-Well-Format erstellt (1:3-Verdünnung, Spalten 6 und 18 waren gleiche Volumen DMSO-Kontrollen) und unter Verwendung von akustischer Dispensiertechnologie auf Assay-bereite Platten dispensiert, um einen 100 nL Stempel der Verbindung und der DMSO-Kontrollen zu erzeugen. Die Assay-Zugaben bestanden aus gleichen Volumen Zugaben von 10 nM EZH2 und der Substratlösung (5 Tµg/mL HeLa-Nukleosomen und 0,25 TµM [³H]-SAM), die mit einem Multi-Drop-Combi-Dispenser in die Assay-Platten dispensiert wurden. Die Reaktionsplatten werden 1 Stunde inkubiert und mit einer gleichen Volumen Zugabe von 0,5 mg/mL PS-PEI Imaging Beads (RPNQ0098), die 0,1 mM unmarkiertes SAM enthalten, gequencht. Die Platten werden versiegelt, 30 Minuten lang dunkel adaptiert und ein 5-minütiges Endpunkt-Lumineszenzbild wird mit einem Viewlux-Imager erfasst. Plattenstatistiken wie Z’ und Signal-Rausch-Verhältnis sowie Dosis-Wirkungs-Kurven werden mit Activity BaseXE analysiert. Die in-vitro-biochemische Aktivität von EZH1 wird als Teil eines 5-gliedrigen PRC2-Komplexes unter Verwendung eines 384-Well-SPA-Assays bewertet, der identisch mit EZH2 ist. Pufferkomponenten, Reagenzienabgabe, Vorbereitung der Verbindungplatten, Quench-Bedingungen und Datenanalyse sind für EZH1 und EZH2 identisch, mit finalen Assay-Konzentrationen von 20 nM EZH1, 5 TµM/mL HeLa-Nukleosomen und 0,25 TµM [³H]-SAM. Weitere Datenanalyse, pIC50-Pivots und Visualisierungen werden durch TIBCO Spotfire ermöglicht. Diese Verbindung wird bei Reaction Biology Corp. (Malvern, PA) profiliert, um die Hemmung in ihrem Panel von Histone Methyltransferase-Assays zu bewerten. Die Methyltransferase-Aktivität wird unter Verwendung der HotSpot-Technologie bewertet, einem miniaturisierten Radioisotop-basierten Filterbindungsassay. Inhibitoren werden in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und in Konzentrationen bis zu 100 uM getestet, mit einer finalen DMSO-Konzentration von 2%. Puffer, der die Methyltransferase in der angegebenen Konzentration und ihr bevorzugtes Substrat, wie in der Begleittabelle gezeigt, enthält, wird mit dieser Chemikalie 10 Minuten vorinkubiert. Reaktionen werden durch die Zugabe von 1 uM S-Adenosyl-L-[methyl-³H]methionin (SAM) initiiert, 60 Minuten lang bei 30 °C inkubiert, gefolgt von der Übertragung auf P81-Filterpapier und PBS-Waschung vor der Detektion.

• Zelllinien

  Breast cancer cell lines (HCC1806, Sk-Br-3, ZR-75-1), prostate cancer cell lines (DU145, PC3, LNCaP)

• Konzentrationen

  ~50 μM

• Inkubationszeit

  6 days

• Methode

  To account for varying doubling rates among cancer cell lines, the optimal cell seeding is determined empirically for all cell lines by examining their growth in a 384-well plate over 6 days with a wide range of seeding densities. Cells are then plated at the optimal seeding density and allowed to adhere overnight. Cells are treated in duplicate with a 20-point 2-fold dilution series of this compound or 0.147% DMSO (vehicle control) and incubated for 6 days at 37C in 5% CO2. Cells are then lysed with 25 μl CellTiter-Glo per well and chemiluminescence is quantified with a TECAN Safire2 microplate reader. In addition, an untreated plate of cells is harvested at the time of compound addition (T0) to quantify the starting number of cells. CTG values after 6 days of treatment were expressed as a percent of the T0 value and plotted against compound concentration. Data are fit with a 4-parameter equation to generate a concentration response curve and the concentration of compound required to inhibit 50% of growth (gIC50) is determined