GW843682X

GW 843682X ist ein submikromolarer Inhibitor der Proliferation der meisten Tumorzellen in Kultur, eine bemerkenswerte Ausnahme ist PC-3, eine Prostatakarzinomzelllinie. GW 843682X ist auch selektiv für Tumorzellen im Vergleich zu normalen diploiden Fibroblasten (HDF), mit einer >10-fachen Potenzdifferenz. GW 843682X ist gleich potent (ca. 200 nmol/L) gegen MES-SA/DX5 und die parentale Linie MES-SA, was darauf hindeutet, dass die Verbindung nicht effektiv durch die P-Glykoprotein-Effluxpumpe in der Zelle entfernt wird. GW 843682X hemmt dosisabhängig die Phosphorylierung von Ser15-p53 durch PLK1 in HeLa-Zellen, die das tet-induzierbare chimäre p53-PLK1-Protein exprimieren. GW 843682X fördert das Auswachsen von HDF-Zellen um 30 % bei 3,3 μM und ist in der Lage, das Auswachsen von H460 bei der niedrigsten Konzentration von 0,37 μM zu fördern. GW 843682X führt zu einem starken G2-M-Arrest bei 3 μM und sehr wenig G2-M-Arrest wird bei 1 μM in HDF-Zellen beobachtet. GW 843682X (3 μM) zeigt einen reduzierten G2-M-Arrest, aber es gibt einen Anstieg des Sub-2N-DNA-Gehalts in H460-Zellen. GW 843682X (0,5 μM) führt zu Zellen, die größer sind als die unbehandelten H460-Zellen und mehrere Kerne aufweisen. [1] GW 843682X hemmt PLK1, PLK2, PLK3 und PLK4 mit Ki-Werten von 4,8 nM, 3,8 nM, 8 nM bzw. 0,163 μM. [2] GW 843682X (1 μM) stört die Lokalisation des endogenen MyoGEF am zentralen Spindel in HeLa-Zellen. GW 843682X (1 μM) stört die Lokalisation von GFP-MyoGEF-wt (GFP-WT), GFP-MyoGEF-T574A (GFP-T574A) und GFP-MyoGEF-T574E (GFP-T574E) am zentralen Spindel in HeLa-Zellen. [3] GW-843682X verursacht eine identische vorzeitige Midzone-Assemblierung und Proteinrekrutierung, was darauf hindeutet, dass die Medikamentenwirkung spezifisch für die PLK1-Hemmung ist. GW 843682X (200 nM) verursacht Mikrotubuli-Bündelung und zentrale Spindlin- und PRC1-Rekrutierungen am Äquator in HeLa-Zellen. [4]

• In-vitro-Kinase-Assays

  PLK1 und PLK3 werden in weißen 384-Well-Assay-Platten in variablen bekannten Konzentrationen in 100 % DMSO hinzugefügt. DMSO (1–5 % Endkonzentration) und EDTA (65 mM) werden als Kontrollen verwendet. Die Reaktionsmischung enthält die folgenden Komponenten bei 22 °C: 25 mM HEPES (pH 7,2); 15 mM MgCl₂; 1 μM ATP; 0,05 μCi/Well [γ-³³P]ATP (10 Ci/mmol); 1 μM Substratpeptid; 0,15 mg/mL Rinderserumalbumin; 1 mM DTT; und 2 nM PLK1-Kinasedomäne oder 5 nM PLK3 in voller Länge. Die Reaktionsmischung (10 oder 20 μL) wird sofort nach Zugabe des Enzyms über automatisierte Liquid-Handler schnell zu jedem Well gegeben und für 1 bis 1,5 h bei 22 °C inkubiert. Die 20 μL enzymatischen Reaktionen werden mit 50 μL Stopp-Mischung [50 mM EDTA, 4,0 mg/mL Streptavidin-SPA-Beads in Dulbecco

• Zelllinien

  H460 and HDF cells

• Konzentrationen

  3 μM

• Inkubationszeit

  72 hours

• Methode

  H460 cells are plated at a density of 2×10³ per well, HDF cells are plated at 5×10³ per well, and the drug-resistant cell line MES-SA/DX5 and its sensitive parent line MES-SA are plated at 7×10³ and 6×10³ per well, respectively, in a 96-well plate. These densities allow vehicle controls to grow logarithmically during the course of the 3-day assay. All cells are exposed to 3-fold dilutions of GW 843682X (30–0.00152 μM) in low-glucose DMEM containing 5% FBS, and 0.3% (v/v) DMSO (HDF cells); RPMI 1640 containing 5% FBS, and 0.3% (v/v) DMSO (H460); or McCoy's 5A containing 5% FBS, and 0.3% (v/v) DMSO (MES-SA and MES-SA/DX5).