CAL-101 (Idelalisib)

Idelalisib (CAL-101) ist nicht empfindlich gegenüber anderen PI3K-Klasse-I-Untereinheiten, einschließlich p110α, p110β und p110γ. Es blockiert spezifisch die FcϵR1 p110δ-vermittelte CD63-Expression mit einer EC50 von 8 nM in primären Basophilen. Diese Verbindung zeigt eine größere Aktivität in Zellen der B-Zell-akuten lymphoblastischen Leukämie (B-ALL) und der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) im Vergleich zu Zellen der akuten myeloischen Leukämie (AML) und der myeloproliferativen Neoplasie (MPN). Es führt zu einer Reduktion von pAktS473, pAktT308 und dem nachgeschalteten Zielprotein S6 in SU-DHL-5-, KARPAS-422- und CCRF-SB-Zellen mit einer EC50 von 0,1 bis 1,0 μM. [1]

Es induziert eine selektive Zytotoxizität in CLL-Zellen, unabhängig vom IgVH-Mutationsstatus oder der Interphasenzytogenetik, hauptsächlich über einen Caspase-abhängigen Mechanismus. Die Verbindung induziert die Zytotoxizität bevorzugt in CLL-Zellen im Vergleich zu normalen B-Zellen, ohne Zytotoxizität in anderen hämatopoetischen Zellen zu erzeugen, im Vergleich zu LY294002. Es fehlt das direkte zytotoxische Potenzial gegenüber T-Zellen und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen). Es kann die Produktion entzündlicher Zytokine, wie IL-6, IL-10, TNF-α und IFN-γ, und aktivierungsinduzierter Zytokine, wie CD40L, hemmen. Es antagonisiert auch das CD40L-vermittelte Überleben von CLL-Zellen. [2]

Es induziert eine Akkumulation von Zellen in G1 und eine Abnahme der S-Phasen-Population in L1236- und L591-Zellen, was diese Verbindung als neue Strategie zur Behandlung des Hodgkin-Lymphoms (HL) kennzeichnet. [3]

• PI3K-Assay

  Der PI3K-Assay wird an Ganzzelllysaten von CLL- oder normalen B-Zellen durchgeführt. Ein PI3K-ELISA-Assay wird durchgeführt. Kurz gesagt, Ganzzellextrakte werden einer Mischung aus PI(4,5)P2-Substrat und Reaktionspuffer, der Adenosintriphosphat (ATP) enthält, zugesetzt und bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von PI(3,4,5)P3-Detektor, gemischt mit EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), gestoppt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird die Mischung aus jeder Vertiefung auf eine PI3K-ELISA-Platte übertragen und 1 Stunde inkubiert. Die Platten werden gewaschen und dann 30 Minuten lang mit einem Sekundärdetektor inkubiert. Die Platten werden erneut gewaschen, und 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidinlösung wird 5 Minuten lang hinzugefügt, woraufhin H2SO4 hinzugefügt wird, um alle Reaktionen zu stoppen. Die Platten werden bei 450 nm auf einem Labsystems 96-Well-Plattenleser abgelesen.

• Zelllinien

  CLL B cells or healthy volunteer T cells or NK cells

• Konzentrationen

  0.01-100 μM

• Inkubationszeit

  48 hours

• Methode

  MTT assays are performed to determine cytotoxicity. 1 × 10⁵ cells are incubated with Idelalisib (CAL-101). MTT reagent is then added, and plates are incubated for an additional 20 hours before washing in phosphate-buffered saline. DMSO is added, and absorbance is measured by spectrophotometry at 540 nm in a Labsystems plate reader. Cell viability is also measured at various time points with the use of annexin/PI flow cytometry. Data are analyzed. At least 104 cells are counted for each sample. Results are expressed as the percentage of total positive cells over untreated control. Experiments examining caspase-dependent apoptosis included the addition of 100 μM Z-VAD. Experiments examining survival signals include the addition of 1 μg/mL CD40L, 800 U/mL IL-4, 50 ng/mL BAFF, 20 ng/mL TNF-α, or coculturing on fibronectin or stromal (HS-5 cell line) coated plates. Stromal coculture is done by plating a 75-cm² flask (80%-100% confluent) per 6-well plate 24 hours before the addition of CLL cells.