JIB-04

Aktives JMJD2E aa 1-350 wird aus E. coli gereinigt und in vitro in Gegenwart von α-Ketoglutarat, 5-10 μM Eisen, Ascorbinsäure und einem Histonpeptidsubstrat in einer gekoppelten Reaktion mit Formaldehyddehydrogenase, ergänzt mit NAD+, verwendet, um die NADH-Produktion zu quantifizieren oder mit dem Epigentek-Kit P-3081. Für Histon-Demethylierungsreaktionen, die mittels Western-Analyse quantifiziert werden, wird ein His-getaggtes hJMJ2D aa 1-350 Expressionskonstrukt, das freundlicherweise von Dr. Y. Shi und J. Whetstine zur Verfügung gestellt wurde, exprimiert und aus E. coli nach den Anweisungen des Qiagen Ni-NTA Agarose-Handbuchs und dem Protokoll von Whestine et al. 54 gereinigt. Kurz gesagt, das Protein wird in 50 mM TrisHCl pH 7,8 + 0,3 M NaCl + 10 % Glycerin + 200 mM Imidazol eluiert und gegen 20 mM TrisHCl pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,2 mM PMSF, 0,5 mM DTT, 8 % Glycerin dialysiert. Das Enzym wird aliquotiert, schockgefroren und bei -80 °C gelagert. Für Aktivitätsassays mittels Western Blot werden ~1,5 μg Enzym mit 0,3 μg H3K9me3-Substrat (Active Motif #31213) in 10 μM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂, 1 mM α-Ketoglutarat und 2 mM Natrium-L-Ascorbat in 50 mM Hepes pH 7,9 in Gegenwart von Vehikel oder Medikament kombiniert und 30 Minuten bis 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. SDS-Probenpuffer wird zu den Reaktionen gegeben, und nach dem Kochen werden die Proben auf NuPage 4-12 % Bis-Tris-Gelen aufgetragen, auf Nitrozellulose übertragen und mit Upstate #07-523 geblottet, um H3K9me3 nachzuweisen. Zum Nachweis des H3-Gesamtsignals verwenden wir Active Motif #39763 (primär) und IRDye 680 konjugiertes Esel-Anti-Kaninchen-IgG (sekundär, LI-COR # 926-32223) und bildeten die Blots in einem Odyssey Infrarot-Bildgebungssystem ab, das freundlicherweise von Dr. M. Cobb zur Verfügung gestellt wurde. Für in vitro IC50-Bestimmungen und Konkurrenzstudien werden typischerweise 100-200 ng gereinigtes Protein mit Vehikel, JIB-04 oder Analoga, wie in den Legenden der Abbildungen angegeben, inkubiert und die Aktivität mittels ELISA gemessen (Epigentek-Kit P-3081 für H3K9me3-Demethylierung, P-3083 für H3K4me3-Demethylierung und P-3085 für H3K27me3-Demethylierung) in Reaktionen, die 50 mM Hepes pH 7,5, 0,01 % Tween 20, 120 nM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂, 1 mM α-Ketoglutarat, 2 mM Natrium-L-Ascorbat und 50 ng Peptidsubstrat enthalten. Die endgültigen Enzymkonzentrationen in den Reaktionen waren wie folgt: 206 nM JMJD2A, 12 nM JMJD2B, 60 nM JMJD2C, 90 nM JMJD2D E.coli, 30 nM JMJD2D Sf9, 30 nM JMJD2E, 30 nM Jarid1a, 35 nM JMJD3. Hintergrundmessungen werden durch hitzeinaktivierte Enzyme, 0,5-1 mM 2,4 PDCA oder Reaktionen ohne 2-OG erhalten. hJMJD2A (aa1-350), gereinigt in E.coli, ist ein freundliches Geschenk von Dr. Jose Rizo-Rey und wird mit 400 ng/Reaktion aufgrund seiner intrinsisch geringen Aktivität getestet. GraphPad Prism Software wird für IC50-Berechnungen und Kurvenanpassung verwendet. E.coli JMJD2D, von uns gereinigt, und Sf9 JMJD2D von BPS lieferten nicht unterscheidbare Ergebnisse. Beachten Sie, dass für Substratkonkurrenzassays, um im linearen Bereich des Assays zu bleiben und die Bindungskapazität der ELISA-Platte nicht zu sättigen, Reaktionen mit > 0,75 μM H3K9me3 unbiotinyliertes Substrat enthalten oder im Detektionsschritt verdünnt und die Signale pro Verdünnungsfaktor angepasst werden. Für die direkte Quantifizierung der H3K9me3-Demethylaseaktivität in Zelllysaten wurden behandelte Zellen (plattiert mit 2 Millionen/10cm-Schale) oder Tumorhomogenate in PBS beschallt (3x 4 Sek.) und gleiche Proteinmengen wurden mit einem Histon-H3K9me3-Substrat in einem Reaktionspuffer mit Kofaktoren für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert, bevor eine spezifische Immun-Detektion des H3K9me2-Produkts mit Epigentek-Kit P-3081-Reagenzien erfolgte. 500 ng E.coli gereinigtes PHD2-Protein in 40 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 20 % Glycerin, 5 mM β-Mercaptoethanol, 10 mM Maltose werden verwendet, um Aktivität im linearen Bereich zu erhalten. Biotinylierte Peptide, die vom HIF-1 ODD stammen (Biotin-Acp-DLDLEALAPYIPADDDFQL oder Biotin-Acp-DLDLEALAP(OH)YIPADDDFQL als hydroxylierte Kontrolle), werden auf Neutravidin-beschichteten 96-Well-Platten immobilisiert. Das Enzym wird in den beschichteten Wells in Reaktionspuffer (20 mM Tris-Cl pH 7,5, 5 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0,12 μM Eisen(II)sulfat, 0,5 mM 2-Oxoglutarat und 1 mM Ascorbat) für 45 Minuten bei Raumtemperatur in Gegenwart der angegebenen Medikamente inkubiert. Das kompetitive Analogon von α-Ketoglutarat, DMOG, wird als positive Kontrolle für die Hemmung verwendet. Die Peptidhydroxylierung wird unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchenantikörpers nachgewiesen, der gegen ein hydroxyliertes HIF-Peptidepitop (Kaninchen-Anti-Hydroxyprolin 4817, Eigenproduktion) erzeugt wurde, gefolgt von der Zugabe eines Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP-konjugierten Sekundärantikörpers. Die Lumineszenz wird in einem EnVision-Plattenlesegerät gemessen. Die Aktivität des rekombinanten LSD1-Proteins wird mit dem Epigentek-Kit P-3075 gemäß dem Herstellerprotokoll mit dem proprietären Inhibitor gemessen.

Human lung cancer cell lines (LCa), primary or immortalized non-tumorigenic HBECs, prostate cancer (PCa), primary prostate stromal (PrSC) and prostate epithelial cells (PrEC).

~10 μM

96 hours

For cell viability assays, cells are plated at 1500-3000 cells/well in 96 well plates and treated the next day with increasing doses of this compound over 4 days and their viability assessed by standard MTS assays using Promega’s Cell Titer or Cell Titer-Glo reagents according to the manufacturer’s protocols. Absorbance at 490 nm and 650 nm or luminescence is measured by a Spectra Max or a FlouroStar Omega plate reader. Data are normalized to the untreated controls (100% viability). Each cell line is tested in 2-5 independent assays, each containing 4-8 replicates. IC50 values are calculated using DIVISA, a high-throughput software, developed in hous, for storing and analyzing drug sensitivity assays. Dose-response curves are plotted using a non-linear regression model and IC50s are determined from the fitted curves. The average IC50 derived from 2-5 independent assays, each containing 4-8 replicates is reported.

Mice harboring H358 xenografts or A549 xenografts

110 mg/kg (H358, i.p.), 55 mg/kg (A549, Oral gavage)

Oral gavage or i.p.