Laduviglusib (CHIR-99021) Hydrochloride

CHIR-99021 zeigt eine über 500-fache Selektivität für GSK-3 im Vergleich zu seinen engsten Homologen CDC2 und ERK2 sowie anderen Proteinkinasen. Darüber hinaus zeigt CHIR-99021 nur eine schwache Bindung an eine Gruppe von 22 pharmakologisch relevanten Rezeptoren und eine geringe hemmende Aktivität gegenüber einer Gruppe von 23 Nicht-Kinase-Enzymen. CHIR-99021 induziert die Aktivierung der Glykogen-Synthase (GS) in Insulinrezeptor-exprimierenden CHO-IR-Zellen mit einer EC50 von 0,763 μM. [1] Zusätzlich zur Simulation der Insulinwirkung erhöht die Hemmung von GSK-3 durch CHIR-99021 (3 μM) freies zytosolisches β-Catenin um das 1,9-fache, was den kanonischen Wnt-Signalweg in 3T3-L1-Präadipozyten nachahmt. Während der ersten 3 Tage der Differenzierung hemmt die CHIR-99021-Behandlung die Präadipozyten-Differenzierung mit einer IC50 von 0,3 μM, indem sie die Induktion von CCAAT/Enhancer-bindendem Protein α (C/EBPα) und Peroxisom-Proliferator-aktiviertem Rezeptor γ (PPARγ) blockiert. [2] Im Gegensatz zu Lithiumchlorid und AR-A014418 reduziert die CHIR-99021-Behandlung die Viabilität von INS-1E-Zellen selbst bei hohen Konzentrationen nicht. Stattdessen erhöht CHIR-99021 die Proliferationsrate von INS-1E-Zellen dosisabhängig und hemmt signifikant den durch hohe Glukose und hohe Palmitat-Konzentrationen induzierten INS-E-Zelltod konzentrationsabhängig. CHIR-99021 fördert die Replikation primärer Betazellen in isolierten Ratteninseln bei Konzentrationen von nur 1 μM, mit einer 2-3-fachen Erhöhung der Zellreplikation bei 5 μM CHIR-99021-Behandlung. [3]

Die orale Verabreichung von CHIR-99021 mit 30 mg/kg verbessert den Glukosestoffwechsel in einem Nagetiermodell des Typ-2-Diabetes, mit einer maximalen Plasma-Glukose-Reduktion von fast 150 mg/dl 3-4 Stunden nach der Verabreichung, während der Plasmaspiegel von Insulin auf oder unter den Kontrollwerten bleibt. Die orale Verabreichung von CHIR-99021 mit 16 oder 48 mg/kg 1 Stunde vor oralen Glukosebelastungen bei ZDF-Ratten verbessert die Glukosetoleranz signifikant mit einer Reduktion der Plasma-Glukose um 14 % und 33 % bei 16 mg/kg bzw. 48 mg/kg, und die höhere Dosis von CHIR-99021 reduziert auch die Hyperglykämie vor der oralen Glukosebelastung. [1]

• Zellfreie Kinase-Assays

  Polypropylen-96-Well-Platten werden mit 300 μL/Well Puffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM Dithiothreitol, 25 mM β-Glycerophosphat, 1 mM NaF, 0,01 % BSA, pH 7,5) gefüllt, der 27 nM GSK-3α oder 29 nM GSK-3β und 0,5 μM Biotin-CREB-Peptidsubstrat enthält. Verschiedene Konzentrationen von CHIR-99021 werden in 3,5 μL DMSO hinzugefügt, gefolgt von 50 μL ATP-Stammlösung, um eine Endkonzentration von 1 μM ATP in allen zellfreien Assays zu erreichen. Nach der Inkubation werden dreifache 100-μL-Aliquote auf Combiplate-Acht-Platten übertragen, die 100 μL/Well 50 μM ATP und 20 mM EDTA enthalten. Nach 1 Stunde werden die Wells fünfmal mit PBS gespült, mit 200 μL Szintillationsflüssigkeit gefüllt, versiegelt, 30 Minuten stehen gelassen und in einem Szintillationszähler gezählt. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt.

• Zelllinien

  INS-1E

• Konzentrationen

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~ 20 μM

• Inkubationszeit

  1, or 4 days

• Methode

  Cells are maintained for 24 hours in starvation medium (culture medium with only 5 mM glucose, 1% fetal calf serum). Then cells are exposed to various concentrations of CHIR-99021 for 1, or 4 days. Cell number is measured by staining of cellular DNA with CyQuant dye, which becomes fluorescent when bound to DNA. Fluorescence is measured after 30 minutes of incubation using the FLUOstar Optima reader. Cell replication is determined by BrdUrd incorporation. BrdUrd labeling solution is added to the medium for the last 4 hours before the cells are fixed using FixDenat solution and incubated with monoclonal anti-BrdUrd-POD antibodies. After substrate solution is added to each well, the light emission is measured in a microplate luminometer using the Analyst HT detection system.

• Tiermodelle

  Female db/db mice or male ZDF rats with type 2 diabetes

• Dosierungen

  ~48 mg/kg

• Verabreichung

  Orally