LDN-214117

Gereinigte rekombinante ALK2-Proteine, ATP, ATP[γ-³²P] und dephosphoryliertes Casein in Endkonzentrationen von 2,5 nM, 6 μM, 0,05 μCi/μL bzw. 0,5 mg/mL werden in Kinasepuffer, der 0,2 % BSA enthält und mit 10 mM MnCl₂ ergänzt ist, in 96-Mikrotiterplatten aliquotiert, in Kombination mit Inhibitorverbindungen, die in variierenden Konzentrationen (0,01 nM bis 100 μM) verdünnt sind. Positive Kontrollproben, die diese Verbindung nicht enthalten, und negative Kontrollen, die keine rekombinante Kinase enthalten, werden ebenfalls gemessen. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 45 Minuten lang reagiert, mit einer Endkonzentration von 2 % Phosphorsäure abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wird auf 96-Well-P81-Phosphozellulose-Filterplatten übertragen und 5 Minuten lang gebunden. Die Platten werden 20 Mal mit 150 μL 1%iger Phosphorsäurelösung pro Vertiefung mittels Vakuummanifold gewaschen. Die Platten werden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur getrocknet, versiegelt und mit Microscint 20 Szintillationsflüssigkeit unter Verwendung eines Spectramax L Luminometers analysiert. Die Daten werden auf positive Kontrollen bei 100 % Enzymaktivität normalisiert, wobei negative Kontrollen als Hintergrund abgezogen werden.

HepG2 hepatocarcinoma cells

100 μM

24 h

Cells are seeded at 25000 cells per well in 96-well plates and incubated for 2 h at 37℃ and 5% CO₂. Compounds of LDN-214117 or DMSO are diluted in DMEM and added at final compound concentrations of 1, 10, and 100 μM. Cells are incubated for 4 and 24 h, after which the media is discarded. Cells are lysed by adding 30 μL of passive lysis buffer and shaken at RT for 15 min. Cell viability is determined by quantifying the ATP present in each well by adding 10 μL of Cell Titer Glo per well and measuring the light output by Spectramax L luminometer. Data is normalized to 100% viability for cells receiving only DMSO.